细胞生长检测1：[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数

[3 H] 脱氧胸苷摄入法测定细胞数

1． 用 RPMI-1640 培养液洗涤对数生长期（培养 3 天）的 CTLL-2 细胞两次，每次 250 × g 离心 10 分钟，洗去培养液中残存的 IL-2 。

2． 用台盼蓝（ 1 ％ Trypan blue ）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液悬浮细胞至 1 × 105 /ml 。

3． 在 96 孔细胞培养板中每孔加 0.1ml 倍比稀释的标准 IL-2 或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准 IL-2 从 40 IU/ml 稀释到 0.019 IU/ml （ 8 ～ 10 个稀释度），阴性对照孔不加 IL-2 。

4． 每孔加 0.1ml 细胞悬液，在 37 ℃ 5 ％ CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 18 ～ 24 小时。每孔加 10 μ l （ 0.5 μ Ci 或 1.85 × 104Bq ） [3 H] 脱氧胸苷，继续培养 4 小时。

5． 用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用 3 ％醋酸水溶液滤纸 3 次，洗去游离的 [3 H]TdR 。将滤纸置液体闪烁瓶中，加入 5ml 闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数， cpm ），根据仪器效率换算成 dpm （每分钟衰变数）。

6． 用 dpm 值对样品稀释倍数作图。在图上，标准 IL-2 的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的 S 型，说明是同样的分子反应。比较同样 dpm 处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。