细胞吸附试验

一、材料和仪器

1. 海拉细胞（ATCC#CCL-2）

2. 96孔聚苯乙烯板（Fisher#07-200-91;Corning#3598）

3. MTT细胞增殖试剂盒（ATCC#30-1010K）

4. 胶原I（Sigma-Aldrich#C7661）

5. 密理博（D-MEM）高糖培养基DMEM（Invitrogen#10313-021）

6. 胎牛血清（ATCC#30-2020）

7. 0.5 M EDTAsolution

8. 牛血清蛋白（Invitrogen#15561-020）

9. PBS（Invitrogen#14190-144）

10. 37°C细胞培养孵育箱及5%CO2

11. 可以在吸收光570 nm 下使用96孔板测量的分光光度计。

二、步骤

1. 在含有10%FBS的DMEM培养基中培养细胞。

2. 制备含有40 μg/ml 胶原I的PBS溶液，4°C保存；含有0.1%BSA的DMEM。

3. 将96孔板每孔加入30 μl 胶原溶液覆盖，置于4°C。

4. 覆盖12小时后，去除胶原溶液，在组织培养罩中于室温下风干平板。

5. 在吸附试验前用血清去除细胞8小时，再用无血清的DMEM洗三次细胞。在DMEM中培养细胞。

6. DMEM中加入EDTA使终浓度为10 mM，用以分离细胞。显微镜下观察细胞确保细胞完全分离，分离过程需要约10分钟。

7. 用无EDTA的DMEM清洗细胞两次；用含有0.1%BSA的DMEM重悬细胞，使细胞在DMEM中的浓度为2×105cells/ml。

8. 为了进行细胞吸附试验，在用血清覆盖的96孔板的每孔中加入步骤7中的100 μl 细胞悬浮液。将平板置于37°C培养细胞20分 钟，使细胞附着在表面。

9. 每孔加100 μl DMEM洗掉没有附着的细胞，重复四次。

10. 注意：为保证实验的一致性，多板操作时可用排枪缓慢加入或移除DMEM。

11. 洗后，加入含有10%FBS的DMEM，37°C孵育细胞4小时。

12. 每孔加10 μl MTT底物，30°C孵育细胞2小时。

13. MTT处理过的细胞会被裂解，用分光光度计在570 nm 检测溶液吸光值。

14. 注意：可以考虑加入下列对照组来检测每一步实验：没有用胶原I覆盖的96孔板；没有用DMEM洗的96孔板；没有加细胞的96 孔板；没有加MTT的96孔板。