正常关节软骨细胞的短期培养

 实验材料：      1.软骨细胞来源：动物材料可选用未成年兔的膝关节、鸡胚胸软骨。人体材料可取自引产胎儿或成年人手术切除的软骨标本；         2.清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2；       3.消化液：0.2%胶原酶Ⅱ溶液，用PBS液配制，过滤除菌；       4.培养液：RPMI1640或Ham F12、DMEM培养基，一般在培养液中加20%—30%的小牛血清；       5.筛网：200目铜网；         实验方法：       1.用手术刀片从关节表面削下软骨组织片，收集在PBS中。反复清洗除去软骨片表面的血液以及可能误带的滑膜组织。新鲜软骨呈乳白浅蓝色、半透明状，略具弹性；       2.将软骨片充分剪成1mm3 以下的组织块，用PBS清洗2次；       3.按组织块与消化液的体积比例为1：10的量加入消化液，置于37℃水浴中轻微振荡消化5h以上，直至软骨组织块基本消失、溶液变浑浊为止。或采用分阶段消化法。即每消化1h就过滤、离心1次，将分离后的软骨细胞立即放入培养液中保存起来，这样反复进行，直至所有软骨组织块消化完全；       4.以1500r/min离心10min。收集细胞；       5.加入PBS清洗细胞；       6.在细胞团中加入培养液制成细胞悬液，用200目铜网过滤，收集滤液；       7.计数细胞，根据需要调节细胞密度；       8.以1×105 —1×106 个/ml的密度接种。置于37℃、5%CO2 、饱和湿度的CO2 培养箱中培养。每2d换1次培养液；       9. 细胞长满瓶壁后，即可传代。届时，用PBS清洗培养物，加入0.125%胰蛋白酶溶液，37℃下消化。镜下观察可见大部分细胞间基质溶解消失。当细胞变圆时，小心倾出含酶液，加入培养液，吹打分散细胞；       10.分瓶接种并培养；