毕氏酵母感受态细胞制备及转化

1、毕氏酵母氯化锂转化法

（1）试剂

1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）

50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）

2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存

注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；

（2）感受态毕氏酵母的制备

接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；

收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；

重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；

离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；

按50ul/管分装，立即进行转化；

注：不要将感受态酵母菌冰浴；

（3）毕氏酵母的转化

煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；

将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；

对于每一个转化，按以下顺序加入：

50% PEG3350 240ul

1M LiCl 36ul

2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul

5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul