一株抗人内皮细胞培养及单克隆抗体的制备与鉴定方法

摘要： 从人脐静脉分离的内皮细胞经培养后免疫Balb/c小鼠，利用小鼠杂交瘤技术，建立了一株持续分泌抗人内皮细胞单克隆抗体的杂交瘤。对其进行了较系统的鉴定，其抗体类别为IgG1。该单抗特异性地识别人内皮细胞，而与血细胞无交叉反应。 关键词：单克隆抗体，内皮细胞 前言： 血管内皮细胞具有多种生理功能，参与机体的凝血，免疫，物质转运和生物活性物质释放等重要的生命活动。因为血管内皮细胞损伤已成为许多疾病发生发展的基本病理过程，外周血液中内皮细胞数目的变化是血管受损的重要标志之一。本实验旨在研制一人内皮细胞的单克隆抗体，研究血管内皮细胞的生理功能，及应用于临床内皮细胞的检测。 1．材料与方法 1.1人脐静脉内皮细胞的培养 内皮细胞的培养 －）所须试剂及溶液的配制及保存。（所须水全用合格的去离子水） １）Hank,s液 用途：用于保存标本 配制：500ml 称：Nacl 4 g KCL 0.2 g MgSO 4 .7H 2 O 0.1 g Na 2 HPO 4 .12H 2 O 0.067 g KH 2 PO 4 0.03 g CaCL 0.07 g 葡萄糖 0.5 g 注意：A,在300-400ML水中依次溶解NaCL、KCL、MgSO 4 .7H 2 O、Na 2 HPO 4 .12H 2 O、KH 2 PO 4 、葡萄糖为A液。 B，在约50ML水中溶解CaCL 2 ……液。 C，将B液缓缓倒入A液中，同时搅拌，……C。 D，在C液中加入1%酚红1ML，混均，加水至500ML，该液即为HaNK,S液，此液便酸。 消毒：10磅10分种高压消毒（消毒时压力波动不能大，否则葡萄糖会沉淀出来，消毒完毕须等 冷却方打开高压锅，以免液体冲出。） 保存：4度。 使用：在使用时加入 5。6% NaHCO 3 调PH至7·2左右，然后加入10%（体积/体积）青链霉素液。 2）5·6%NaHCO 3 液； 用途：调节溶液的PH值。 配制： 50ML 称量：NaHCO 3 2.8g 注意：在约40ML水中溶解NaHCO 3 ，再加水至50ML即可，NaHCO 3 溶解缓慢，故可适当加热 消毒： 10磅 10分钟高压消毒。 保存：4度。 3） 1%酚红液； 用途：作溶液的指示剂。 配制：100ML 称量：酚红 1g 注意：A）在于1N NaOH 2ML溶液中溶解酚红；酚红较为困难，所以在研钵中进行，不断研磨至溶。 B）待溶解后片刻，再加入1ML 1N NaOH C）加水至100ML，配制完毕。 消毒：加入其它溶液中一起高压灭菌。 保存： 4度。 4） 青/链霉素原液； 浓度：1万单位青霉素、1万单位链霉素或1Mg链霉素/ML。 配制：*无菌操做* A）80ML水 10磅 10分钟高压灭菌。 B）溶解80万单位的青链霉素于80ML水中。 分装：1～2ML小分装。 保存：-20度 使用：按1%（体积/体积）加入溶液中，终浓度100万单位青链霉素/ML 5) L-谷氨酰胺液； 浓度：30mg/ML 配制：10ML 称量：L--谷氨酰胺10ML 消毒：过滤除菌。 保存：小分装存于--20度 使用：A）用时终浓度为0.3Mg/ML B)具体用法：M199《含血清》/L-谷氨酰胺=100ML/1ML 注意：化冻后混均。