Cell Culture Procedure

1、复苏细胞 1）液氮中取出所要的细胞，37℃水浴锅中快摇，勿让水入盖，同时将培养液放入37℃水浴锅中温育； 2）将细胞离心，同时进入超净台，无菌操作，将培养液瓶用卫生纸擦干，除菌后放入超净台，将盖子打开，瓶子放在架子上，瓶口朝火焰，将吹打吸管灭菌后吸部分培养液进入培养皿； 3）离心完毕，将细胞冻存液倾倒掉，吸入约1ml培养液到冻存管中，反复吹打，悬起细胞，吸入皿中，吹打，标好； 4) 显微镜下观察，呈圆形，不结块，不聚在一起，浓度适宜并且均匀，放入培养箱中培养。 2、传代： 1）倒掉培养液，加含5%胰酶的培养液（T/E），37度或室温消化10-15min，显微镜下观察细胞是否脱落，脱落完全后吸入无菌 离心管 ； 2）离心，加适量培养液重悬分装到培养皿中； 3）显微镜下观察后放入培养箱中培养； 3、转染细胞： 1）计算所要转染的质粒量和lipofectamin量，如60mm CHO-1K，10μg 质粒/well加20μl LF2000； 2）37℃ 水浴 锅中温育培养液，500μl Opti-MEM 加质粒 温育5min，同时500μl Opti-MEM 加 LF2000 温育小于5min； 3）将上述两份混合在一起形成Mix，室温温育20min； 4）温育同时，用无血清培养基（D/F）洗2-3次，晃几晃； 5）在所要转染的细胞中加入1-2ml D/F，再将温育完毕的Mix加入细胞中，晃均匀，显微镜下观察后放入培养箱中培养； 6) 培养6-8小时后观察，细胞如果一切正常的话，换含血清的培养基，换液时要洗2-3次，换液后继续培养24-36小时。 配方： IMDM培养液（购自GIBCO公司)，含10%胎牛血清(FBS)、1%非必需氨基酸、1μM 二氢睾酮（DHT）（培养附睾上皮细胞需要加，COS7不用）（以上均购自PAA公司）； T/E：培养基中含有：5%胰 蛋白酶 ，0.53M EDTA ）