培养细胞的生物学特性检查

一、培养细胞的常规观察 培养细胞在体外的生长过程是一个动态的连续过程，细胞的数目、形态以及培养基的颜色、澄明度等在一定程度上都是细胞生长状况的表现。借助于肉眼或显微镜的帮助，通过对上述常规指标的观察，可以有效地帮助我们及时把握细胞的生长信息，适时、适当采取相关措施培养好细胞。 （一）培养基的观察 培养基的颜色和澄明度是肉眼观察的两个重要指标。新鲜的培养基一般呈现桃红色，pH值约为7.2-7.4，培养过细胞后的培养基由于含有大量细胞代谢产物而使得pH值降低，颜色也逐渐变黄。培养基颜色的这种变化是由其所含有的酚红指示剂来显示的，酚红会随溶液的pH值变化而改变颜色，成为指示培养基pH值的最直观指标。培养基颜色变黄是细胞需要换液的信号。一般情况下，大多数细胞需要每2-3天换液一次。需要注意的是，如果细胞在换液或传代后培养基很快就会变黄，这可能是细菌污染或培养瓶不干净造成的。 正常情况下，无论颜色如何变化，培养基都能保持澄明。一旦发现培养基变混浊，就应注意是否有污染发生。上市情况多适用于贴壁生长的细胞，对于悬浮生长的细胞来说，随着细胞密度的升高，培养基也会在一定程度上变浑，判断其是否污染应结合溶液颜色变黄的速度、细胞增殖的速度、显微镜下是否可观察到菌丝（正菌污染）以及其他一些方法进行判断。 （二）显微镜检查 利用光的衍射与干涉原理制造的相差显微镜是观察透明活细胞的最佳工具，可以清晰地帮助我们看到生活状态下细胞的形态结构特点，并动态观察和记录细胞的附着、贴壁、伸展、移动、分裂等过程。 在不具备相差显微镜的实验室，普通的倒置显微镜也不失为一种好的观察工具。生长状况良好的细胞在倒置显微镜下观察时较为明亮、折光性也强，细胞的轮廓不清但形态规则。生长状况不佳的细胞在倒置显微镜下观察时折光性变弱、轮廓变得清晰，细胞形态也变得不规则，细胞间的间隙变大，细胞中常出现颗粒样物质，情况更严重时，还可见到脱落死亡的细胞增多。 二、细胞活力测定

• 台盼兰染色测定细胞活力

1、原理 死细胞和受损细胞的细胞膜通常因缺损而不完整，这样某些染料分子便可穿过细胞膜进入到细胞内部并使细胞被染上相应的颜色。与死细胞和受损细胞不同，活细胞的细胞膜结构完整，能阻止染料进入细胞而拒染（dye exclusion）。台盼兰便是这样的染料，经台盼兰染色的死细胞或受损细胞常为浅兰色。除台盼兰外，伊红、苯胺黑也是常用的鉴定细胞活力的染料，所不同的是，经伊红和苯胺黑染色的死细胞或受损细胞分别为红色和黑色。 2、仪器、用品与试剂 血细胞计数板、显微镜、微量加样器、0.4%台盼兰溶液（用PBS溶液配制）。 3、操作步骤 （1）将贴壁细胞用胰蛋白酶消化后再经Hank’s液洗涤后制备单细胞悬液，并适当调整细胞密度在10 6 个/ml左右。 （2）取细胞悬液0.5ml加入一小试管中，加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟。。 （3）用微量加样器吸取少量细胞悬液加入到血细胞计数板上的小室中。 （4）显微镜下计数500个细胞，分别数出死细胞和活细胞数目，计细胞活力。 （5）结果判定：死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见其为浅兰色的细胞，活细胞不能被染色，镜下呈无色透明状。      细胞活力（％）＝（总计数细胞数－着色的死细胞数）÷总计数细胞数×100％ 4、注意事项 （1）和台盼兰溶液混合后的细胞悬液不可放置时间过长，因为活细胞对染料也有一定摄取能力，若时间太长，活细胞也会被染色。 （2）细胞悬液和台盼兰溶液的用量可根据实验条件及要求进行必要调整。 （3）血细胞计数板用完后要及时用双蒸水、70％酒精认真清洗计数板和盖玻片并用擦镜纸擦干后保存。