甲醇酵母表达的试验步骤

在甲醇酵母中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。

但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。

1、酵母菌株的分离纯化

接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

2、pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养

TOP10F’做为菌种保存在－70℃条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。

接种TOP10F’于5ml LLB（加入25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培养16～18小时。

3、毕赤酵母表达的试验方法

3.1线状质粒DNA的脱磷酸化处理

重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。如对载体pPC19选用BgiⅡ线性化，转化后可得到Muts表型转化子；选用SaI或StuI线性化，转化后可得到Mut+表型转化子。

为了防止载体质粒DNA的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理酶切后的质粒DNA，具体操作如下：

（1）建立反应体系：

线性化的质粒 35ul

10x CIP buffer 4ul

CIP 1ul

ddH2O 5ul

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total 45ul

（2）在PCR仪上控制反应温度（加石蜡油封闭），37℃，15 min ；50℃，15 min；56℃，30 min（灭活）。

（3）在56℃未开始前停止，加入proteinse K ，用于灭活CIP，加入试剂如下：

反应物 45ul

10x 5％ SDS 7ul

10x EDTA （pH 8.0） 7ul

proteinse K 5ul

ddH2O 6ul

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total 70ul