乳酸脱氢酶硝基蓝四唑盐法

乳酸脱氢酶硝基蓝四唑盐法

乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LDH)是辅酶I(NAD)依赖性脱氢酶，能氧化乳酸为丙酮酸，为无氧糖酵解途径的标志酶。硝基蓝四唑盐法显示LDH活性的原理与显示SDH活性的原理基本相同，只是需加用NAD，氢从反应生成的还原型辅酶I(NADH)传递给四唑盐，将其还原为甲脂。

1)孵育液配液

0．06mol/LPBS 0．25ml1．0mol/LD，L乳酸钠 0．1ml0．4％NAD 0．1ml0．4％NBT 0．25ml0．1mol/LKCN 0．1ml0．5mol/LMgCl： 0．1ml蒸馏水 10ml

2)操作程序：

①固定：用预冷的2％多聚甲醛(0．1mol/LPBS，pH 7．4配制)灌注固定5分钟；②洗涤：用冷PBS灌流冲洗固定液；③取材：取所需组织，用PBS洗3次；④切片：冰冻切片或振动切片，裱于涂有黏附剂的载玻片上：⑤孵育：在上述孵育液中，暗处反应5分钟，室温下反应30分钟；⑥封片：洗涤、脱水、甘油明胶封固和镜检。

3)结果：

酶反应阳性部位呈蓝色。该酶对固定剂的耐受性较好，采用先固定后孵育，可保存结构防止酶扩散。为了防止定位异常，在底物中加入聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可使底物黏稠度增加，防止反应产物扩散。

4)对照实验：

除去孵育液中的底物，结果应为阴性。

乳酸脱氯建四唑盐法

大鼠骨酪肌(舌)纤维横断面呈蓝色为乳酸脱氢酶阳性反应