生物素标记凝集素的组织化学染色程序
生物素标记凝集素的组织化学染色程序生物素(biotin)与亲和素(avidin)具有非常高的亲和性。1分子亲和素可与4分子生物素结合。故可利用这一特点,先将生物
生物素标记凝集素的组织化学染色程序
生物素(biotin)与亲和素(avidin)具有非常高的亲和性。1分子亲和素可与4分子生物素结合。故可利用这一特点,先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合,再制备辣根过氧化物酶标记的亲和素―生物素复合物(avidin-biotin-peroxide complex,ABC),该复合物可含数个辣根过氧化物酶分子。又因复合物中的亲和素未被饱和,除与辣根过氧化物酶―生物素结合外,尚有一定的位点可与其他生物素结合。
因此,实验中可通过生化反应将凝集素结合在另外的生物素上.当标记生物素的凝集素与组织细胞膜的单糖结合后,再用ABC复合物中亲和素与该生物素结合,在糖基的位置可形成一个较大的复合物,以增加检测的敏感性。其染色程序如下:
1.切片脱蜡处理同前:
2.小鼠肝粉(10ug/ml,PBS配制)或生物素阻断剂孵育切片?室温10分钟,抑制组织中内源性生物素;
3.3%H2O2孵育10分钟(阻断内源性过氧化物酶,避免假阳性),PBS漂洗2次,每次5分钟;
4.用适当稀释度的生物素标记凝集素室温孵育切片45分钟:
5.PBS漂洗2次,每次5分钟;
6.ABC液孵育切片.室温30分钟,用前配制,可按试剂盒说明书操作,将20ul亲和素加20ul HRP标记的生物素,溶解在1.0mlPBS中;
7.PBS漂洗2次。每次5分钟;
8.呈色 加入DAB液暗处10~15分钟,室温;
9.流水冲洗;分钟,必要时可用苏木精复染,光镜观察记录;
10.结果 阳性部位呈黄棕色。