细胞色素氧化酶二氨基联苯胺显示法（DAB法）

细胞色素氧化酶二氨基联苯胺显示法（DAB法） 氧化酶(oxdase)和脱氢酶(dehydrogenase)均使底物脱氢“氧化”，所不同的是氧化酶将氢与氧结合，而脱氢酶则把氢传给其他物质即受氢体，如辅酶I(NAD)，辅酶Ⅱ(NADP)或黄素蛋白。 细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，CCO)在细胞有氧呼吸中起重要作用，为线粒体膜固有酶，是线粒体标志酶之一，常作为细胞内氧化代谢指标。在含有大量线粒体的细胞内均有高强度细胞色素氧化酶活性。 3，3，―二氨基联苯胺(3，3，―diaminobenzidine，DAB)在细胞色素氧化酶的催化下，其侧链氨基被氧化，并进行反复氧化性聚合和氧化性环化，形成不溶性褐色吩嗪(phenazine)聚合体，DAB将氧化型细胞色素C还原，还原型细胞色素C又被细胞色素a再氧化。通过该循环的反复进行，DAB不断被氧化，反应氧化物沉积。DAB氧化物含有活性游离基，该游离基能使四氧化锇还原形成锇黑，故可在电镜下观察。 (1)孵育液配制 蒸馏水 5ml 3，3，―二氨基联苯胺-4-盐酸盐 5mg 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 7．4) 5ml 过氧化氢酶C―100 lmg 细胞色素CⅢ型 10mg (2)操作程序 ①新鲜或固定组织冰冻切片，厚5～10um； ②孵育液中37℃孵育40～60分钟，充分洗涤； ③复染：亚甲蓝染核； ④甘油明胶封片。 (3)结果 酶活性部位呈棕褐色沉淀，细胞内线粒体数目多者酶活性强。 细肭色素氧化酶DBA法 大鼠骨骼肌纤维横断和纵断面中呈棕色为细胞色素氧化酶阳性反应 (4)对照实验 孵育液内加1mmol/L KCN或l0mmol/L NaN3，反应完全呈阴性。抑制剂为氰化物、叠氮化钠(NaN3)、硫化氢(H2S)和一氧化碳，原因是这些物质均能与细胞 色素氧化酶的三价铁结合而抑制酶活性。从反应液中去掉底物DAB不能成为对照，因为DAB同时也是成色剂。