外源基因在真核细胞表达技术

本篇中主要介绍生化方法及物理方法（电穿孔法）

一、生化方法

1、磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞

（1）转染前24 h，通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm组织培养皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃温箱孵育20～24 h。转染前1 h换液。

（2）按照下属方法制备磷酸钙-DNA沉淀：于5 ml灭菌塑料管内混合100μl 2.5 mol/L CaCl2与25μg质粒DNA，如有必要用0.1×TE（pH7.6）将体积补至1 ml。室温下将以上2×钙-DNA溶液与等体积的2×HEPES盐溶液混合。迅速弹敲试管侧壁混匀溶液，静置1 min。

（3）立即将磷酸钙-DNA悬液转移至上述单层细胞的细胞培养基中。每1 ml培养基加0.1 ml悬液。轻轻摇动平皿混匀培养基，培养基会变成混浊的橘黄色。一旦形成DNA沉淀，转染效率会大大降低，因此此步动作应尽可能迅速。如果是用氯喹、甘油与/或丁酸钠处理细胞，直接进行步骤5。

（4）如果转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5%~7%CO2的37℃温箱孵育。2～6 h后，吸去培养基与DNA沉淀。加入5 ml 37℃预热的完全培养基，将细胞放回孵箱孵育1～6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者如果是稳定转化则直接进行步骤7。

（5）在磷酸钙-DNA沉淀物的存在下用氯喹处理细胞或者吸去沉淀溶液后将细胞暴露于甘油与丁酸钠中会促进细胞吸收DNA。

2、用氯喹处理细胞

氯喹是一种弱碱，推测是通过抑制细胞内溶酶体水解酶降解DNA而发挥作用（Luthman and Magnusson 1983）。细胞对氯喹毒性的敏感度限制了培养基中加入氯喹的浓度及时间，不同细胞所需氯喹最佳浓度根据经验而定。

（1）在把磷酸钙-DNA沉淀物加入细胞前或后按1：1000将100 mmol/L氯喹直接加入培养基中。

（2）细胞于含5%~7%CO2的37℃温箱中孵育3~5 h。

（3）在用DNA于氯喹孵育细胞后，移去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，加5 ml预热的完全培养基。细胞于孵箱中培养1～6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者直接进行步骤7以获得稳定转化子。

3、丁酸钠处理细胞

丁酸钠的作用机制并不确定；但它是组蛋白乙酰化形成使外来质粒DNA趋于转录的染色质结构（Workman and Kingston 1998）。

（1）甘油休克处理后，将500 mmol/L丁酸钠直接加入生长培养基（甘油处理的步骤d）。细胞类型不同，所用丁酸钠的浓度也不同。例如：

CV-1 10 mmol/L

NIH-3T3 7 mmol/L

HeLa 5 mmol/L

CHO 2 mmol/L

其他细胞系所需浓度依经验而定。