乳过氧化物酶法（LPO）

本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为20～40%。 　　1．原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用，生成125I+，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。 　　2．方法以标记蛋白质抗原为例。 　　（1）反应液组成：蛋白质2～5μg溶于磷酸缓冲液10～25μl中，加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl)； 　　（2）在室温保温7min； 　　（3）加入H2O2200ng(10μl)； 　　（4）过7min再加入H2O2(3μl)； 　　（5）保温7min后，加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应； 　　（6）10min后加入NaI载体溶液1ml ； 　　（7）按常规方法分离纯化。 　　3．注意事项 　　（1）LPO质量好坏，可直接影响标记率，LPO应在使用前新鲜配制，以防酶活性降低。 　　（2）LPO用量应小于总蛋白质用量的1%，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。 　　（3）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。 　　（4）碘化反应在pH4.0～8.5较宽范围内均可进行，最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。 　　（5）H2O2应保持低浓度，如高于0.1mmol/L，对酶的活性将有抑制作用。