单细胞琼脂糖凝胶电泳Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)

一、 细胞悬液的制备 ： 1. 吸弃旧培养基，D-Hanks冲洗2遍 2. 0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入 离心管 ，1000rpm，离心10min，弃上清，以1mlD-Hanks悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞2~3×10 6 个，必须分散成单个。悬浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。 二、玻片制备 ： 1. 玻片磨砂。 2. 制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4 PBS配制。称0.1g溶于20mlPBS，如NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.65%。 铺第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温>5min使其固化，即为第一层胶； 第二层胶：37℃ 0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2×10 6 ）细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱>5min，使其固化。 * 余下的细胞1000g×10min离心，于0.1-0.2ml悬浮缓冲液中混匀，做Western-blot。 三、细胞溶解 ： 1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃>1小时或过夜。玻片在细胞消化液中可至少存放4周。 细胞溶解液配制 NaCl 146.1 g Na2EDTA 37.2 g Tris base 1.2 g 用约12克NaOH调节pH至10。 用去离子水定容至890ml。过滤除菌，为贮备液。室温保存。 应用液 加入 Triton X-100 至 1% DMSO 至 10%（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基） 应用前冷藏30~60分钟。 4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2mm，无气泡。放置10~30分钟，本室一般采用15min，使DNA解链。25V, 300mA电泳20分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压) 电泳缓冲应用液： 10N NaOH 30.0 ml（12克） 200mM EDTA 5.0 ml （二钠为0.372g） (附言：电泳缓冲液储备液： 10N NaOH 200g/500ml水，两周内用。 200mM EDTA 14.89g/200ml水，pH=10,室温保存。） 定容至1000ml，混匀，电泳前新鲜配制。 可通过改变液面高度来调节电压。 5、中和： 切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5min。 中和缓冲液： Tris base 48.5 g 去离子水 定容至1000ml 用>10 N HCl调节pH至7.5。室温保存。 6、染色 呈中性后，凉干玻片，50μl EB应用液染色，盖上新盖玻片。 EB染色液(10×贮备液) EB 1 mg 去离子水 20 ml 室温避光保存。 临用时将贮备液稀释10倍。使终浓度为5μg/ml 以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。 7、镜检及结果评价 EB染色后的DNA样品应尽快在 荧光显微镜 下观察。未受损细胞表现为以圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。 用目镜测微尺或拍摄×400倍照片再作判断。每个样品中至少随机挑选25个细胞测定。 彗星尾长度 <35μm为未损伤 35-70μm为中度损伤 >70μm为重度损伤