限制性酶切片段差异展示（RFDD-PCR）

差异显示方法的基本原理是将具有可比性的细胞在某一条件下可表达的mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的cDNA 群体，以此为模板，利用一对特殊引物，即3anchor 引物和5arbitrary引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的标签（tags），然后用变性聚丙烯酰胺测序胶分析其差别，将有差别的基因克隆化，进一步分析其结构与功能。 差异显示方法的优点在于：（1）仅需0.2ug总RNA作为起始材料；（2）可同时分析多组样品；（3）敏感性高，可检出低丰度mRNA；（4）实验周期短，约8天即可完成［7］，便于重复；（5）最突出的优点是实验过程中可步步验证比较。差异显示方法方法因有上述优点，被广泛应用。但也存在的不少问题，概括起来有两方面：一是假阳性多（约50％～70％），二是得到的有差异cDNA片段短（约为110～500 bp）。为了解决这一问题Qbiogene和 KPL公司分别开发了第二代的差异显示技术。 第二代差异显示系统 限制性酶切片段差异展示（RFDD-PCR）系统，解决了在标准差异显示中重复性的问题。在这些差异显示中,使用特殊设计的与cDNA配对接头和一系列特殊设计的引物，特异性的PCR引物的使用和下游的PCR反应使RFDD-PCR分析具有高度的重复性。 对原核和真核都有用 因为RFDD-PCR技术不使用以poly(A)为引物的PCR扩增，因而该系统对原核和真核系统皆适用。由于在原核组织中有相对较低mRNA拷贝，因此只需要32个表达窗，而在真核 生物 中需64个表达窗。 特点 * 高度严谨的PCR可以产生结果一致的基因表达图谱 * 重点放大和展示编码区 * 对原核及真核RNA都有用 * 完全消除假阳性 在图谱中估计和辨别已知基因 使用RFDD-PCR，图谱的信息对于产生一部分与展示片段相对的基因来说是足够的了。当与disploy Fit网络相连后，这些基因可以帮助我们去确定哪个基因是我们准备下一个去研究的潜在基因。 重点展示编码区 在标准的差异显示系统中，一个引物特异性地作用于一个poly(A)尾，因此与3’端未翻译区域相对应的差异表达序列大部分被鉴别出，因为TaqI优先切割翻译序列，通过这种方法充分表达编码区。这个特征使这些基因片段适合于下游功能分析，在这些分析中使用的技术需要表达的序列。