细胞固定观察法

体外培养细胞除可直接观察活细胞外，还可以用固定细胞的方法将细胞制成永久标本进行观察。固定染色观察，既可显示细胞形态，也可揭示细胞的微细结构，是细胞培养中常用的观察技术。其基本技术为固定染色和观察。一、细胞固定基本方法无论用双盖片悬浮培养、加盖片单层培养还是悬液培养，都能将细胞固定染色，其中以盖片培养最常用。其步骤为：（1）培养时加入一清洁盖片。（2）待盖片长满细胞或所需的适宜时期用镊子轻轻取出盖片，迅速投入37℃Hanks液中漂洗两次，每次3～5秒钟，以洗除血清防止其妨碍染色；如用悬液培养的细胞时，需离心(800rpm)，除去含血清的培养液，再向沉降细胞中加入少许温Hanks液，用吸管轻轻吹打漂洗后，留少许悬液，再做涂片，凉干后固定。（3）固定  将上述玻片浸于固定液15分钟。常用的固定剂有甲醇/醋酸、FAA固定液、Carnoy。甲醇/醋酸浓度为甲醇3分，冰醋酸1分，现用现配，适用于观察染色体和Giemsa染色。FAA固定液浓度为：80%酒精90.0mL，冰醋酸5.0mL，中性福尔马林(40%甲醛，用时向瓶中加过量MgCO3中和)5.0mL。适用于盖片单层培养，固定效果好。Carnoy是较好的非水溶性固定液，浓度为纯酒精60.0mL，氯仿30.0mL，冰醋酸10.0mL，适用于显示细胞化学成分等方法，如粘多糖等，对固定培养单层细胞效果很好。但穿透力差。二、常用染色方法1、H．E(苏木精一伊红)染色法H．E染色法是细胞化学染色方法中最常用的一种方法。其基本原理是用碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，并能提供良好的核浆对比染色。染色的基本材料为：苏木精染液    苏木精                  0.5g                                   溶于70mL蒸馏水中    铵矾(NH4)2SO4AL2(SO4)3   24.0g     H2O                      5.0mL  再加入甘油30mL和冰醋酸2mL混合均匀，    NaIO3                    0.1g   滤纸过滤备用。    伊红                     0.5g   溶于100.0mL蒸馏水中。染色过程为：样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明和封固等。注意贴壁生长的细胞用盖玻片培养法制备样品；悬浮生长的细胞用离心甩片机制备样品。染色的步骤(盖片培养法为例)：（1）用镊子轻轻取出已在培养瓶中培养一段时间，细胞基本长成单层的盖玻片，用37℃温PBS漂洗3次，每次20秒～1分钟；（2）将盖玻片浸入中性福尔马林30分钟；（3）PBS洗2次，每次1分钟，蒸馏水漂洗1次，浸入用蒸馏水稀释的苏木精液(1/20)染色10分钟；（4）自来水浸洗，置入1%NaHCO3液中洗至蓝紫色；（5）伊红水溶液中染30秒～1分钟；（6）蒸馏水洗，迅速通过丙酮2次，每次3～5分钟；（7）通过2:1丙酮/二甲苯3次，每次1～2分钟；（8）通过1:2丙酮/二甲苯3次，每次1～2分钟；（9）通过纯二甲苯5～10分钟；（10）把盖片细胞面向上，置载物玻片上，用树胶封存，再覆以较大盖片。也可以用95%酒精作为固定液，用稀盐酸酒精溶液(75%酒精配制1%盐酸)作为分色液，用淡氨水溶液(在400mL自来水中滴2滴浓氨水)使胞核蓝化。其染色的基本步骤为：①将有细胞的盖玻片用温PBS洗3次后，浸入95%酒精固定15分钟。②PBS洗2次，每次1分钟，然后浸入苏木精染液，染色5～10分钟。③自来水浸洗后，浸入稀盐酸酒精溶液，数秒钟，进行分色。④自来水浸洗后浸入淡氨水中3～5分钟，使胞核蓝化。⑤自来水浸洗后浸入伊红染液，染色5～10分钟。⑥自来水浸洗，经70%、80%、90%酒精各1次，95%酒精2次和100%酒精3次逐级脱水，每次1分钟。⑦通过二甲苯3次，每次1分钟。⑧在载玻片上滴加中性树胶，将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻片上。光镜下观察，细胞呈粉红色，细胞核呈蓝紫色。2、Giemsa染色法Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。其主要用Giemsa染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。Giemsa染色的基本材料为：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余的甘油混在一起，56℃保温2小时后，加入33mL纯甲醇，保存于棕色瓶内。染色的基本步骤为：（1）准备染液：用pH6.81～7.38的Sorensen缓冲液，按1:9比例取Giemsa染液和Sorensen缓冲液混合配成染色液；Sorensen缓冲液的配制：pH6.81：Na2HPO4(1/15M)  50mL + KH2PO4(1/15M)  50mL;pH6.98：Na2HPO4(1/15M)  60mL + KH2PO4(1/15M)  40mLpH7.17：Na2HPO4(1/15M)  70mL+ KH2PO4(1/15M)  30mL；pH7.38：Na2HPO4(1/15M)  80mL + KH2PO4(1/15M)  20mL。(2)细胞标本用甲醇固定10分钟，或用1:3醋酸/甲醇固定30分钟，用滴管把染色液布满玻片上，注意不要有气泡，用染色缸染色亦可，染10～15分钟；(3)用自来水冲去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光学树脂胶封固。染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染色。染色完毕将标本浸入水中洗除染液。Giemsa染色光镜下观察细胞核呈紫红色或蓝紫色，细胞浆成粉红色。三、特殊染色方法随着组织化学和免疫细胞化学技术的发展，细胞染色方法也有了较大的发展。为了能够鉴别细胞中的DNA，Feulgen于1924年提出了Feulgen染色法。有些科学家把血清学方法和显微示踪方法结合起来又形成了免疫细胞化学染色法，如免疫荧光染色法和免疫酶染色法，这些为进一步分辨细胞的形态和细胞细微结构提供了更为先进的手段和技术。(一)Feulgen染色法此法的基本原理是细胞中的DNA在60℃用1N HCl酸解离脱氧核糖核酸，使嘌呤碱基与糖苷键破坏，嘌呤碱脱掉，脱氧核糖中的醛基游离，醛基能与Schiff试剂相结合，形成一种紫色的复合物。1、Feulgen染色的基本材料：(1)1N HCl：用浓HCl 8.5mL+蒸馏水91.5mL稀释。(2)Schiff氏剂：将碱性品红0.5g加入到100mL煮沸的蒸馏水中，再煮3～5分钟，冷却，过滤；冷却至25℃时，再加入1NHCl 10mL，偏重亚硫酸钠1.5g，装入棕色瓶中，盖紧，黑纸包裹存于暗处；漂洗液用10%亚硫酸钠溶液10.0mL加蒸馏水200.0mL，1N HCl 10.0mL，现用现配。2、Feulgen染色的基本步骤(1)将细胞置入培养瓶中培养一段时间，将长成单层的盖玻片取出，用Carnoy或醋酸/甲醇固定20～30分钟。(2)室温下置入1N HCl 1～2分钟。(3)再投入60℃ 1N HCl 8～10分钟。(4)在10℃暗处投入Schiff剂中染色1～5分钟。(5)取出在漂洗液中漂洗2次，每次2分钟。(6)在蒸馏水中漂洗2次，每次2分钟。(7)用75%→100%的酒精依次脱水，每次1分钟。(8)用二甲苯透明2次，每次3分钟。(9)用树胶封片，封实后盖片上加微型重物加压，置数日，树胶干后观察。本方法中酸的离解是关键，温度过低或酸度不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；反之，酸解过分，导致DNA完全解聚，染色反应会减弱。细胞中RNA对酸比较稳定，醛基难游离，不被着色，故此法能对DNA进行特异性染色。Feulgen染色后，细胞核成粉红色至紫红色，胞质为无色。(二)免疫荧光染色法此法基本原理是将已知抗体或抗原标记荧光素，用此特异性试剂，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本，借助抗原抗体的特异性结合，于抗原或抗体的存在部位呈现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。1、主要使用材料(1)0.01mol/L PBS  称取NaCl 8g，Na2HPO4. 15g，KH2PO4 0.2g,加蒸馏水至1000mL溶解后，调pH至7.2。(2)0.5mol/L硫酸盐缓冲液(CB)  称取NaHCO3 3.7g，Na2CO3 0.6g，加蒸馏水至1000mL，溶解后调pH至9.5。(3)50%缓冲甘油  1分纯甘油加1份CB。(4)伊文氏蓝溶液  称取伊文氏蓝1g，加入100mL PBS中，溶解后加1mL 1%NaCO3过滤；4℃保存。临用前取0.1mL，加9.9mL PBS稀释成0.01%浓度使用。(5)特异性抗体(第一抗体)  荧光素标记抗体（第二抗体）。(6)染色缸、湿盒、振荡仪、荧光显微镜。2、染色的基本步骤(1)细胞准备  将7mm×22mm盖玻片置入培养瓶中，加入对数生长期细胞悬液于培养瓶中，待细胞长成单层，取出盖玻片，用PBS洗2次；悬浮生长的细胞离心后用PBS离心洗涤2次，制成细胞涂片。(2)细胞固定  用醋酸/甲醇或95%酒精固定20～30分钟。(3)将固定的细胞玻片置入盖片染色缸，用PBS振洗5分钟，取出吹干。(4)滴加稀释的荧光素标记抗体(0.01%伊文氏蓝溶液稀释)，在湿盒中37℃保温30～60分钟。(5)PBS振洗2次，每次5分钟，然后用蒸馏水振洗1次。(6)用50%缓冲甘油封片。标本染色后应及时观察并照相，若暂时无时间观察则应将标本放入4℃冰箱保存。但过夜后特异性荧光会减弱。如用聚乙稀醇封片，则保存时间可适当延长。制标本和染色时必须设立阳性对照、阴性对照、空白对照及抑制试验，以排除非特异性染色。要控制显色反应时间，以阳性反应着色最强，而有的是刚开始着色为佳。滴加抗体的量要适当，防止液体干涸。此种染色法在荧光显微镜下观察，阳性部位出现荧光。荧光素种类不同可出现不同颜色的荧光。如异硫氰酸荧光素呈黄绿色荧光，罗丹明B220呈橙红色荧光。(三)免疫酶染色法ABC免疫酶染色法即卵白素—生物素—酶复合物法，是目前最敏感的免疫细胞化学染色法之一。其基本原理是将特异性第一抗体与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素化桥抗体与第一抗体结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性将生物素化辣根过氧化酶连接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。此法灵敏性高，对比度佳。1、使用的主要材料磷酸盐缓冲液(0.01mol/L, pH7.4 PBS)；Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L, pH7.6 THB)；底物溶液[临用前称取50mg3.3'二氨基联苯胺(DAB)，溶解于100mL THB中，过滤，然后加20uL 30%H2O2，及时使用]；ABC试剂盒(美国VECTOR公司产品，包括正常马血清、生物素化马抗小鼠IgG或马抗兔IgG、卵白素—生物素化辣根过氧化物酶复合酶)；小鼠(兔)特异性抗体；盖片染色缸、湿盒、显微镜等。2、染色的基本步骤(1)细胞准备与固定，同免疫荧光染色法.(2)取已固定的细胞盖片,用PBS洗5分钟,浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 5mL+PBS 200mL) 37℃3分钟，以阻断内源性过氧化物酶。(3)PBS振洗2次，每次3分钟。(4)滴加正常马血清，在湿盒内，37℃保温30分钟，以消除非特异性染色。(5)弃去正常马血清，滴加小鼠特异性抗体，在湿盒内37℃保温30～60分钟或4℃下过夜。(6)PBS振洗3次,每次3分钟,滴加生物素化马抗小鼠IgG，在湿盒内37℃30分钟。(7)PBS振洗3次，每次3分钟，滴加ABC复合剂，在湿盒内37℃30分钟。(8)PBS振洗2次，THB振洗1次，每次3分钟，浸入新鲜配制的底物溶液，在室温下置暗处10～20分钟。(9)自来水洗5分钟(若采用显微分光光度计进行定量分折，则无需作细胞核衬染，直接进行脱水、透明和封片)。(10)细胞核衬染  浸入苏木精染液染色2分钟，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。(11)逐级脱水  过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1分钟。(12)透明，过二甲苯溶液3次，每次1分钟。(13)将有细胞的面向下，用中性树脂封片。此种染色方法同免疫荧光染色一样，也应设置阳性对照、阴性对照、空白对照和抑制试验。空白对照用PBS做第一抗体。抑制试验是将待检标本与未标记特异性抗体反应后，再用自己标记的特异性抗体进行染色，结果阳性强度减弱或转为阴性。其注意事项同免疫荧光染色法。此法染色结果在光镜下观察，阳性部分呈棕褐色。(四)细胞银染色法此法用于嗜银蛋白分析。其基本原理是：核仁形成区(nucleolar organizer regions NORs)是位于某些近端着丝染色体短臂上含编码核蛋白体RNA(rRNA)基因rDNA片段的环状DNA。这个区存在的相关嗜银蛋白(Ag NORs)是核仁内高度磷酸化，并对银有亲和作用的酸性非组蛋白，对rDNA的转录、rRNA合成、加工和装配起着重要的作用。AgNORs的含量可反映细胞增殖活性，其含量越高，表明细胞增殖越快。用银染色法能特异显示细胞AgNORs，通过计数AgNORs颗粒和测量AgNORs面积，可定量分析细胞AgNORs。1、银染色法需要的基本材料 50%硝酸银和1%甲酸(v/v)需用去离子水配制；2%明胶甲酸溶液(称明胶2g，溶入1%甲酸溶液100mL)；应用染色液(在暗室内将2%明胶甲酸溶液和5%硝酸银溶液按1:2的容积比混合)需在染色前新鲜配制；洁净的盖片染色缸、吸管、载玻片、镊子等。2、染色的基本步骤(1)细胞准备与固定同前。(2)固定后的细胞玻片浸入去离子水中使其水化。(3)将应用染色液滴加于细胞玻片上，室温下避光染色1小时。(4)用去离子水反复冲洗，95%～100%系列酒精脱水。(5)用二甲苯透明。(6)中性树脂封片。染色液配制一定要用去离子水。注意染色时间，不同组织标本染色时间不同，其长短直接关系到AgNORs颗粒的计数结果，特别要注意。计数时每例样本不得少于30个细胞数。染色片在光镜下可见到细胞核内散着大小不等的黑色颗粒。定量分析可用目镜形态定量学方法和自动图像分析法。前者采用0.5网形目镜测微尺测量细胞核AgNORs颗粒数，以相互不连的颗粒定为一个计数点。后者采用图像分析仪自动定量分析，先在光镜下对待核细胞定位，通过摄像系统将细胞图像信号输入计算机，计算机对每一视场的颗粒个数及每一颗粒面积进行自动识别和计数。(五)考马斯亮蓝(Coomassie, BB)染色法这是一种显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法。1、需用的材料固定液[0.1mol/L磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)14.0mL, 0.1N磷酸氢二钠(NaH2PO4·12H2O)36.0mL，加蒸馏水50.9mL，相混合后再加25%戊二醛50.0mL]；染色液(甲醇46.5mL，冰醋酸7.0mL，加蒸馏水46.5mL，相混合后加考马斯亮蓝染料0.02g)。2、染色的基本步骤(1)细胞准备  用支持物盖片培养法，待细胞长满70～80%。(2)将有细胞的盖片从培养瓶中取出，投入固定液中固定15分钟。(3)先置蒸馏水漂洗2分钟，再用蒸馏水冲洗两次，每次1分钟。(4)置入考马斯亮蓝染液中染色60分钟。(5)先置蒸馏水漂洗2分钟，再用蒸馏水冲洗两次，每次1分钟。(6)置入含甲醇冰醋酸液碟皿中(不含染料)，在倒置显微镜下观察可见细胞质内微丝逐渐明显，背地清亮时终止。(7)按(3)方法漂洗。(8)用70%～100%酒精逐级脱水。(9)用二甲苯透明。(10)用树胶封固。染色清晰的关键在第(6)步，要特别注意。染色片镜下观察，细胞内微丝呈现蓝色。