细胞培养的必备设施、常用器材和培养基

第一节  细胞培养的必备设施根据体外培养细胞生长特点和条件，拥有一个无菌实验室、一台超净工作台和一个恒温培养箱是细胞培养的三大必备设施。一、无菌实验室无菌实验室或操作室的设计原则是，有防止微生物污染和有害因素的影响措施，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。无菌实验室最好能单独设置。如果条件有限，只能限制在一个大实验室内，应划分不同的功能区或用铝合金隔板隔开，将无菌操作室与清洗、消毒灭菌区、制备、储藏和孵育区分开。无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域。亦可把净化工作台置于操作室中，这样更为安全。此室最好能与外界隔离，不能穿行或受其他因素干扰。操作室的大小依需要而定，一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。更衣间放在外，主要供更换衣帽、鞋子等。缓冲间位于更衣间与操作间之间，也可同时和几个操作间相通。操作间放在内间，主要供无菌操作和细胞培养，房间应不受日光直射，大小适当，高度适宜(2.5m)。房间过大，清扫和消毒不便；过小，操作不便；顶部过高会影响紫外线的有效灭菌效果。墙壁应光滑无死角，以便清洗和消毒。工作台不应紧靠墙壁放置，台面漆成白色或灰色，以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。若能购置超净工作台则更好。无菌操作间应为密闭式，设置空气消毒用的紫外线灯、空气过滤净化器和恒温装置。如果条件有限，仅做一般要求的细胞培养，在相对狭小的空间内，只设置净化台而不设操作室。但要注意季节气候环境的影响和注意无菌操作环节。做要求较高的细胞培养，最好设置无菌操作室，有条件的应设净化工作室，以避免季节影响和杜绝污染。二、净化工作台也称超净工作台。目前大多数从事细胞培养工作的实验室都已装备了超净工作台。这种工作台占据空间小，安装方便，操作简单，投资少，效果不比无菌操作室差，即使不设置单独的无菌实验室，只要购置安装了超净工作台，也能进行简单的细胞培养工作。超净工作台种类繁多，但主要有三大类：一类是测流式；第二类为流直式；第三类为外流式，或称为水平层流式。它们的基本工作原理大同小异：内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器过滤净化后，让净化空气徐徐通过台面空间，使操作区构成无菌环境。它们的区别在于气流的方向不同，侧流式即净化后气流由左侧或右侧通过台面流向对侧；直流式为气流从上向下或从下向上流动；外流式为气流向操作者方向吹来。这三类工作台各有利弊。侧流式和直流式能形成气流屏而保持操作台无菌，但在净化气流和外界气体交界处可因气流的流动形成负压，使少许未净化气体混入，有可能发生污染，尤其在多雨季节的南方，会增加污染机会。外流式工作台因气流面向操作者流动，外方气流不易混入，但在做有害实验时，对操作者健康不利。使用此类工作台一般可用有机玻璃将上半部遮挡，让气流从下方通过，以尽量减少其不利影响。现在很多实验室普遍使用的侧流式工作台,是一种封闭式的工作台,两个侧面各留两个圆洞，供操作者手臂伸入进行操作，污染机会极少。但要拿取较大物品或进行较大范围的操作就不够方便。超净工作台作为一种设备也需要维护和保养，才能延长其使用寿命。一般应注意以下几点：（1）超净工作台一般宜安装在避免日光直射、清洁无尘的房间内。若能放在无菌操作区内则更佳，不仅效果好，而且滤器（料）的使用寿命长。（2）久未使用的工作台在使用前应进行彻底清洗、消毒灭菌。用1:1000的来苏儿或75%的酒精擦洗台面，滤器械的灰尘可用真空吸尘器清除。停止使用时最好用作防尘布或塑料布套好，避免灰尘积聚。（3）净化工作台内不应放置其他与细胞培养无关的用品，更不能用作储存室。每次使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机，然后进行培养操作。（4）不设在无菌操作区内经常使用的净化台，要注意过滤器的效果。一般2~3年更换一次，3~6个月拆下清洗一次，以保持过滤器的净化效果。三、恒温培养箱用于细胞培养的培养箱分变通电热恒温培养箱和CO2培养箱。温控变化一般不超过±0.5℃,最适温度为37℃。因此要求培养箱具有较高的灵敏度。控温装置的优劣是电热恒温箱质量的关键，选购时一定要注意。一般选购隔水式或晶体管式控温培养箱，适用于封闭式的培养。CO2培养箱在细胞培养实验室已得到普通的使用。它能提供较为恒定的CO2，通常为5%，使培养液的pH保持稳定，适用于开放式或半开放式的培养。需要注意的是：为了避免污染，要对培养箱定期进行消毒，如有紫外灯则用紫外线消毒，如无紫外灯须用酒精定期擦试消毒。另外，要维持箱内温度、湿度的恒定，可用无菌蒸馏水定期注入外箱内，或用无菌潮湿的纱布置于托盘内，然后将培养皿、培养板置于上面，再放入CO2培养箱，以保持湿度，避免培养液蒸发而影响细胞生长。四、其他设备进行细胞培养除了上述三大设备外，还需配备电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜和倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、消毒器、抽滤装置等。电热干燥箱：主要用于烘干热消毒玻璃器皿，也可用于干热消毒。在用于干热消毒时，温度一般要求达到160℃(灭菌)或180℃(去除热原)，消毒时间须在2h以上。细胞培养实验室常用的干燥箱为鼓风式电热干燥箱（规格为5605 mm×500 mm×500mm），虽然升温较慢，但温度均匀，效果较好。鼓风与升温同时开始，待温度达100℃后再打开，以避免玻璃器皿突然遇冷而炸裂损坏。金属解剖器械、塑料制品、橡胶制品等不能放在干燥箱内灭菌。冰箱：一般用双门冰箱，既有4℃左右的冷藏区，又有-20℃以下的冷冻区。如条件许可，应有一台普通冷藏冰箱和一台低温冰箱（<-70℃）。前者主要用于储存培养液、生理盐水、Hanks液、试剂等培养用的物品和短期保存的组织标本。后者用于保存需较长时间存放的制剂，如酶、血清和组织标本等。冰箱应保持清洁，防止污染。禁止存放有毒、易燃、易挥发物品。显微镜：应有一台普通显微镜和一台倒置显微镜。前者用于细胞计数和一般观察，后者用于观察细胞的生长情况和有无污染。若条件许可，应配置照相系统和荧光显微镜。水纯化装置：这也是细胞培养不可缺少的设备。因为体外培养细胞对水的要求较高，无论是细胞培养液还是配试剂等都应使用两次以上蒸馏的双蒸水。离子交换装置处理的水因为不能完全去除有机物而极少应用。外售蒸馏水常用金属器蒸馏，易混入金属离子，须用玻璃蒸馏器重新蒸馏一次后才能使用。目前国内普通使用的是自动双重纯水蒸馏器(碳管加热)，较为安全、方便、蒸馏速度也较快，但不宜直接用自来水蒸馏。配制培养液的水应用配液前蒸馏的新鲜三蒸水。细胞冷冻贮存器：主要是液氮容器。国产的能满足要求。容积大小根据实验室需求选购。一般小实验室用35L3的，大实验室，多可购50 L3的。窄颈瓶维持液氮时间长（1月左右），但存取不方便。宽颈瓶存取方便，但维持液氮时间短（7~10天）。定期加液氮的时间可据此来确定。由于液氮温度达-196℃，使用时要防止冻伤手。离心机：一般应配有普通离心机，最好应配置高速冷冻离心机。普通离心机转速在4000r/min以下，台式的就可满足要求。用于制备细胞悬液、漂洗、分离细胞。若开展细胞脱核、DNA和RNA抽提、组织匀浆等研究，需使用高速、大容量和能进行调温的离心机。清毒器：一般常用小型手提式高压蒸气消毒器。它可用于无法干热高温烘烤消毒的各种塑料培养用品、橡胶制品等的消毒。抽滤装置：有Zeiss滤器、玻璃滤器和金属滤器。滤器中的滤膜一般用0.2～0.3μm孔径的微孔滤膜。凡在高温或射线下易发生变性或失去功能的物质，如人工合成培养液、血清、消化用胰酶等都须用滤器过滤除菌。 第二节 细胞培养常用器材及处理方法体外培养细胞使用的器材品种较多。由于离体细胞对各种毒物都很敏感，所以细胞培养所用器材的清洗、消毒处理是培养能否成功的关键之一。一、玻璃器材常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管等。无论是初次使用还是培养后重复使用的玻璃器材均需要进行消毒处理。首次使用的玻璃器材应先用自来水初步刷洗，然后用稀盐酸溶液（1%）浸泡过夜，再用自来水冲洗，最后处理方法与重复使用的器皿的处理。重复使用的玻璃器皿的处理步骤：（1）刷洗。用软毛刷和优质中性洗涤剂刷洗，去除器皿内外表面的杂质。刷洗时注意不要用力过重，以防损坏器皿内表面光洁度，影响细胞生长；也不能留有死角。器皿数量大时，可使用超声波清洁装置，冲洗干净后晾干。（2）清洁液处理。将刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重铬钾清洁液中。清洁液配方如下，见表3-1：表3-1   清 洁 液 配 方

 该清洁液具有高度腐蚀性，操作时必须穿长筒胶靴，戴防酸橡皮手套，围裙和眼镜，以防清洁液溅出而灼伤。在配液时还需注意将酸缓慢放入水中，以防酸遇水放热产生酸溅出或使玻璃及陶制容器裂开而使清洁液外泄。切勿将水加入酸中，以防酸溅出。常用清洁液为75%和50%两种。将玻璃器皿放入时最好装入塑料网袋内，再浸入清洁液中，玻璃瓶内不要残留气泡。一般浸泡12~24小时后取出。在清洁液中取出的器皿先用自来水冲洗10次以上，再用单蒸水冲洗三次以上，最后用双蒸水（或去离子水）冲洗1~2次，晾干，包装杀菌。一般用121℃磅高压蒸气灭菌20分钟。玻璃滤器使用后及时用自来水冲洗滤器表面的剩余物，然后用单蒸水浸泡，除去滤板内堵塞杂物，若用滤膜则将滤膜丢弃，加4N盐酸浸泡12小时以上，用自来水冲洗，再用单蒸水抽滤2次，双蒸水(或去离子水)抽滤冲洗、包装、121℃高压蒸气灭菌20分钟。也可用5%洁消精浸泡20分钟后，再按上述方法冲洗和灭菌。二、塑料器材体外培养细胞中塑料器皿的使用越来越多，有进口的，也有国产的。主要有多孔培养板、培养皿、培养瓶及吸嘴。多孔培养板有4孔、6孔、24孔、96孔等规格可供选择。多数为进口产品，已消毒灭菌密封包装，使用时只需打开即可。有一次性使用的，也有反复使用的。在我国不少实验室，由于经费有限，经过清洗和消毒灭菌再使用的较多。塑料器皿若使用后，先用自来水浸泡冲洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，或先用2%NaOH处理之后再用3%HCl浸泡30分钟，最后用自来水冲洗干净，并用双蒸水冲洗3次以上，晾干。消毒采用紫外线直接照射或辐照灭菌办法。清洗时要防止产生划痕，以免影响细胞的贴附性。所以，培养要求较高的细胞的塑料器材，最好一次性使用。三、橡皮器材应选择质软、耐高温、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的塞子、盖子。新购置的橡皮制品，用自来水冲洗去除其表面粉粒和污物。先用5%氢氧化钠煮沸15分钟，用自来水冲洗8次，再用4%盐酸煮沸15分钟，用自来水冲洗8次，单蒸水冲洗3次，双蒸水(或去离子水)冲洗一次，晾干后包装或置于铝盒内，用121℃高压蒸气灭菌20分钟。已用过的橡皮制品，先用自来水冲洗干净，然后用洗衣粉加热煮沸10分钟后，用自来水边冲边用力搅动，以充分洗净残余洗衣粉，然后用蒸馏水煮沸2次，每次15分钟，再用单蒸水冲洗2次，必要时还要用双蒸水(或去离子水)冲洗一次，晾干后包装或放于铝盒内，用121℃高压蒸气灭菌20分钟。四、金属器材细胞培养中需用多种金属器材，用于解剖、取材、剪切组织及持取物件等，常用的有剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等。新的金属器材，先用纸擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氢钠煮沸15分钟，擦干后再用95%酒精纱布擦干，包装或置铝盒内于121℃高压蒸气灭菌20分钟。已用过的金属器材，及时用酒精棉球擦干净，包装入铝盒内于121℃高压蒸气灭菌20分钟。五、其他物品纱布先用自来水洗净后，再用单蒸水冲洗，然后用单蒸水煮沸2次，每次15分钟，并经常用长镊子翻动，再用单蒸水洗2次，晾干后折成八层包装，用121℃高压蒸气灭菌20分钟。注射器的针头使用后，立即用自来水（或来苏尔水）冲洗数次，冲洗出针头内的剩余物，以免堵塞针头，然后用单蒸水洗2~3次，再用95%酒精冲洗3次，包装或置铝饭盒内121℃高压蒸气灭菌20分钟。用于细胞培养过程中的各种人工合成培养液、缓冲液和酶滤液等也需要进行除(灭)菌处理。缓冲液常用高压蒸气消毒。血清用56℃水浴灭活30分钟。人工合成培养液等酶溶液用过滤除菌。安装滤器时要防止滤膜装偏而导致过滤失效，过滤时力量不能过大、过猛，以免滤膜破裂。滤液量多，用抽滤式或加压式（正压式）过滤装置。滤液量少，可选用2.5cm直径的小号滤器，直接套在小瓶（如青霉素瓶）上，以注射器推动压力过滤。消毒灭菌前所用的包装材料可用牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒和特制玻璃（或金属）消毒筒等，可根据器材大小、形态选用，采取局部包装或部分包装，并用线绳扎紧。 第三节 常用溶液、培养液及其配制体外细胞培养过程中使用溶液和培养液的好坏，直接影响到细胞的生长，配制时要十分注意。一、平衡盐溶液平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)又称生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。(一)配液时的注意事项（1）需用新鲜的三蒸水或去离子水，按规定的先后顺序配制，称量要准确，要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等，切勿搞错。（2）物质的纯度  纯度高的物质配制成的溶液质量高，因此在配液选用时要注意。常用的纯度有优级纯(特级纯)，分析纯（AR）和化学纯（CD）三种类型。（3）物质的可溶性  很多用于培养用液的化学物质都很难溶解，在配制时必须设法使其溶解。如磷酸钙在碱性溶液中几乎难于溶解，因此在制备磷酸缓冲液时，需将CaCl2及磷酸氢二钠单溶后再混合，临时用NaHCO3调pH至弱碱性，以避免沉淀析出。（4）物质的不稳定性  不少物质性质不稳定，高温高压下易破坏。如葡萄糖只能在10磅下维持15～20分钟，若超磅葡萄糖就会破坏。5、贮存液  通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。(二)几种常用溶液的配制方法1、无钙、镁、离子溶液(1000ml)   氯化钠(NaCl)   8g            磷酸二氢钠(NaH2PO4H20)   0.05g   氯化钾(KCl)   0.2g           碳酸氢钠(NaHCO3)        1g   柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20)1g   葡萄糖                  1g   加去离子水或双蒸水至1000mL2、磷酸盐缓冲液   甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液       磷酸氢二钠(无水)   28.4g    氯化钠     8.77g       加去离子水或双蒸水至1000mL   乙液：0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液       磷酸二氢钠(无水)   2.4g    氯化钠     8.77g       加去离子水或双蒸水至1000mL甲、乙液于4℃保存，使用时按表3-2所示比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。 表3-2  不同pH浓度所需甲液、乙液量 (mL)

 3、Hanks液(1)母液甲(20x)配法  ① NaCl(A.R)   160g      KCl(A.R)      8g             MgSO4.7H2O（A.R) 2g          MgCl.6H2O(A.R) 2g      依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。  ②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌（此液应单配，单溶）。待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4℃保存。(2)母液乙(20×)配法  ① Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g       KH2PO4(A.R)     1.20g           葡萄糖(A.R)     20.0g      溶于800ml双蒸水中。  ②0.4%酚红液  0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01N NaOH 11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4℃保存。待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40℃保存。(3)使用液（1×）配法取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115℃高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏)，置室温后4℃保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。二、其他溶液1、pH调节液(1)碳酸氢钠液  可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后，需经过滤除菌，分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%浓度的安瓿封装品，使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液或以CO2调节之。(2)Hepes缓冲液  是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为10～15mmol/L。配制时，称取所需的Hepes量，用培养液溶解，用1mmol/LNaOH调节pH至7.0，过滤除菌分装小瓶中，4℃冰箱保存。2、消化液(1)胰蛋白酶溶液  它是一种黄白色粉末，易受潮，应密封放置阴暗干燥处。它的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来。常用浓度为0.25%或5%。如5%胰蛋白酶溶液配制：称0.5g粉状胰蛋白酶，溶于100mL无钙镁离子磷酸缓冲液中，置4℃过夜使其溶解，或将称好的胰蛋白酶放入有刻度的烧杯中，先加入一半的磷酸缓冲液，在杯中放入一长短适宜、外周包有塑料或玻璃外壳的磁力棒，将烧杯放置在带有控温和控速的磁力搅拌器上，令磁棒匀速旋转搅拌1-2小时后，胰蛋白酶充分溶解，用滤纸粗滤后，再用玻璃或塑料滤器过滤除菌，分装入小瓶，4℃保存，同时做无菌试验阴性后才能使用。(2)EDTA(乙烯二胺与乙酸或Versene)溶液  EDTA是一种化学螯合剂，毒性小，对贴壁细胞有离散作用。一般使用浓度为0.02%。称0.1gVersene溶解于500mL无钙镁离子磷酸缓冲液中，15磅30分钟高压灭菌，4℃或室温保存。(3)胰蛋白酶—EDTA的配制    0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4mL，无钙镁离子缓冲液100mL。3、抗生素溶液     为防止细胞培养过程中发生污染，一般在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素，其浓度分别为每毫升含100U和100μg 。配制时取青霉素1×106和链霉素1×106μg,溶于100mL Hanks或PBS中，使其含量为青霉素1×104U/mL，链霉素1×104μg/mL，使用时每100mL培养液中加入0.5~1mL。       4、0.5%台盼兰(Trypan blue)液       称取台盼兰0.5g，溶于100mL磷酸缓冲液中，溶解后滤纸过滤，室温保存。   5、0.1%结晶紫的配制   称0.1结晶紫，溶于0.1N的100mL柠檬酸溶液中，(即2.1g柠檬酸加水100mL)， 置37℃溶解24小时，分装备用。三、培养基维持体外培养细胞生存和生长的液相基质，称细胞培养基或简称培养液。理想的培养液必须具备以下条件：  (1)保持正常细胞渗透压及pH缓冲系统。  (2)必须供给细胞基本营养物，包括细胞合成代谢、能量代谢及微量元素等。  (3)培养液中没有毒物或抑制细胞生长的物质。  (4)各种基本成分的量合适，互相之间具有平衡关系，能精确定量调整。  (5)容易制成成品，生产简单，最好能高压灭菌。  培养基的种类较多，作用略有差别。凡是能供细胞生长繁殖的培养基称为生长液。若细胞生长快，在生长液中维持时间不长，可从瓶壁脱落下来，或者由于生长密度过大，使显微镜观察困难。为避免此现象的出现，常在细胞成片后改换成维持液，这种维持液可使细胞在数周内处于良好的状态，特性不变，可随时供应。此种维持液为无血清或低血清(2%)培养液。如199培养液不加血清就是良好的维持培养基。有时此种培养基中加入明胶或脱脂乳。还有一种由Smith设计的、含有超滤的肝消化物作为维持培养基。(一)天然培养基(natural medium)天然培养基主要是取自动物体液或从动物组织分离提取的物质，如血清、鸡血浆、鸡胚浸出液等。其营养成分丰富，培养细胞有效。最初的体外细胞培养大多用这种培养基。但由于成分复杂，个体差异大，来源有限，又很难标准化，所以实际工作中，往往是天然培养基结合在人工培养基中使用。如血清和水解乳蛋白是使用非常广泛的天然培养基，市场有现成产品出售，不需自制，可省去许多麻烦。1、血清血清是全血凝固后分离上清液而得的制品，其除了含有供给细胞生长所不可缺少的营养成分外，还使细胞合成DNA，提供细胞增殖所必须的生长因子。血清的主要成分为蛋白质、多肽、激素、氨基酸、葡萄糖、铜酸等。细胞培养最常用的是牛血清，除了其营养价值较其他血清高，还有以下优点：（1）它的胎盘能阻止母体的免疫球蛋白进入胎牛而没有抗体等的抑制效应物质。 （2）较易获得。牛血清共分三类：①小牛血清(calf serum)，取年龄在6个月，体重达226kg的小牛放血致死而得。②新生小牛血清(new born calf serum),出生5天内的小牛放血后得。③胎牛血清(fetal borvine serum)，以无菌手术剖腹后取胎(210～300天胎龄)，穿刺心脏采血制得。一般市售血清均为混合血清，有成分互补的优点，更适宜于细胞生长。购置的血清应做热灭活处理。将小牛血清置于56℃水浴中灭活30分钟，以破坏补体及一些污染微生物(如病毒、支原体等)，放置4℃冰箱中，无菌试验阴性。未灭活的血清不稳定，应保存于-20℃冰箱中。血清虽对细胞生长极为重要，但其成分复杂，作用机制尚未完全了解，加上供血动物的个体差异，其中有些成分对分析细胞生物学反应不利，有的甚至对细胞有害。所以在生长液中血清使用浓度为10%～20%，维持液为2%～3%，有时根据培养目的，甚至需要用无血清培养基。2、水解乳蛋白(hydrolytic albumin)水解乳蛋白也是一种常用的天然培养基。它是乳蛋白经蛋白酶和肽酶混合物水解而得的制品，为一种均匀淡黄色或灰黄色粉末，有潮解性，故常密封保存在阴凉干燥处。其水溶液呈弱酸性，不溶于醇或醚。常用浓度为0.2%～5%，用平衡盐溶液配制。0.4%浓度的水解乳蛋白经分解后几乎与人血浆中氨基酸成分相当。在此培养基中再加入血清，可培养很多种细胞。市售产品每批都有差别，应先预试。0.5%水解乳蛋白的配制：称取0.5g水解乳蛋白粉末，用少许灭菌的Hanks液调成糊状，再补充Hanks液至100mL，待充分溶解(室温置1~2h)后，粗滤分装，以115℃20分钟高压蒸汽灭菌，无菌试验阴性，置4℃冰箱保存备用。3、酵母浸出液该液在无血清蛋白存在时可促使细胞增殖。酵母浸出物中有几种结合蛋白的物质对增加细胞的生长率特别有利。它还含有丰富的维生素，故天然培养基中也常加有酵母浸出物成分，常用浓度为0.1%。4、鸡胚浸出液鸡胚浸出液含有生长因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，可刺激细胞生长增殖，几乎各种组织细胞培养物都可使用。常用浓度不能超过30%。近几年，由于培养基的广泛使用，鸡胚浸出液的使用已大为减少。鸡胚浸出液的制备：取孵育10～20天的鸡胚，用洗液洗三次后剪碎或搅拌后加入Hanks液并搅均匀，注意气囊、膜囊和尿囊膜必须剥离去除。置室温或在37℃下孵育30分钟或更长时间，并采取冻融方法以助析出浸出液。2000r/min离心沉淀20分钟，取出上清，作无菌试验阴性，加双抗；分装后低温保存，也可采用过滤法除菌。5、鸡血浆鸡血浆含有纤维蛋白原和其他一些营养成分，是使用最早的天然培养基。缺点是易于液化，故很少单独使用。鸡血浆制备：在无菌条件下配制0.2%生理盐水肝素液，115℃20分钟高压灭菌或过滤除菌，分装入小瓶。取消毒过的干燥注射器先吸少许肝素，湿润针管内壁，选择年幼的鸡，从翼静脉采血。3000 r/min 离心10分钟,分装入小瓶,于-20℃冰箱保存备用。6、胰酶消化牛心肌浸液该浸液主要用作支原体检查。制备方法如下：（1）新鲜牛心用蒸馏水洗两次，切开除去内膜、脂肪及结缔组织等，用绞肉机将心肌绞碎，称取250g加双蒸水900mL，加NaCl 5g，放入三角烧瓶内。（2）56℃水溶加温10～20分钟，再加入胰酶2.5g，待胰酶全部溶解后用NaoH调节pH至8.0，以增强消化能力，于56℃消化2小时，并不断搅拌，保持pH8.0左右。（3）将心肌消化悬液用HCl调至pH6.0左右，煮沸5-10分钟，再用四层纱布滤去肉渣，略加压力将肉汁挤出，将浸出液加双蒸水至1000mL。（4）加酵母浸膏1g搅拌之，调pH至8.0再煮5分钟，四层纱布（中间垫一层脱脂棉）过滤，再用cp滤纸过滤，pH保持在8.0，即成牛的心肌浸液，115℃15分钟高压灭菌，置4℃冰箱保存备用。(二)人工合成培养基天然培养基的来源是有限的，要进行大量体外细胞培养，需要选用人工合成的各种化学物质配制而成的、又利于细胞生长的培养基。1950年，Morgan提出了包括69种成分的199配方，开始了人工合成培养基的历史，它是在平衡盐溶液中加入标准的化学营养物质而构成的培养基。随着生物化学的飞跃发展，人们不断应用生化提纯或人工合成的各种化学物质设计出许多种合成培养基的配方，企图找到最有利于组织细胞生长的培养液，如199，Eagle 、RPMI1640、HAMF12、NCT109等。1、人工合成培养基的优点人工合成培养基具有以下优点：（1）人工培养基是用已知成分配制，培养条件一致。（2）它可以精密地测定培养的细胞与培养液内物质变化的情况，用生化定量的方法可以分析各种组织以及各种实验条件下不同组织细胞的生长和代谢，这也可提供和筛选更加有利于细胞生长的更趋简化的培养基。（3）用人工培养液培养的细胞比较透明清楚，胞浆内的颗粒很少，换液时间可适当延长，从而节省人力、物力。（4）人工合成培养基克服了天然培养基中可能潜在病毒污染的缺点，有利于培养和研究病毒。（5）培养基成分便于储存和大量配制，便于细胞大量生产。2、人工合成培养基的成分 人工合成培养基的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些辅助物质。这些营养物质的主要作用见前一章。随着科学技术的进步和细胞培养技术的发展，人工合成培养基不仅品种增加，配方相对固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培养基成分趋于简单化。现今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培养液比以前已有了较大改进，增减了一些成分，以满足细胞培养中新技术的需要。如杂交瘤技术中常用的DMEM培养基，使用时需补加丙酮酸钠和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促进分裂原的反应和DNA合成，增加细胞转化。2-Me常配制成0.1mol/L的贮存液，用时每升培养液加0.5mL。PHA有市售的商品。3、几种常用人工合成培养基的配制(1)RPMI1640培养液   称10.4g粉末(市售进口产品一般为一包)，溶于1000mL三蒸水中，待溶解后通入CO2约5分钟，至液体呈柠檬色后加入0.3g/L谷氨酰胺，或先用1 N HCl调至pH6.8以下，后用1 N NaOH调至pH7.2～pH7.4；用无菌玻璃滤器或金属滤器0.22μm或0.3μm微孔滤膜过滤除菌，按所需量分装,置低温保存。(2)Eagle基础培养基  称9.4g粉末(一小包)加入1000mL三蒸水中，待完全溶解后采用121℃高压蒸气灭菌15分钟，临用前按比例加入谷氨酰胺，并用10%NaHCO312.5mL～22mL(或通入CO2)，调pH7.２～pH7.4，过滤除菌，低温保存。(3)生长培养液   根据各种细胞培养的需要，在配制人工合成培养基时，尚需加入一定量的天然合成培养液，构成最适合细胞生长的培养液，加入适量血清的生长液就是其中的一种。这种培养液主要为细胞生长增殖之用，所含血清比例较大。一般配法：基本培养基80%～90%，小牛血清10%～20%，并加双抗生素(青霉素100U/mL，链霉素100μg/ml)，上述比例如有特定需要，可根据细胞培养要求进行增减。(4)维持液   这也是在基础培养基上配制的细胞培养用液，主要作用是维持细胞缓慢生长而不死。一般血清含量较少，通常基本培养基为97%～98%，小牛血清3%～2%。(5)无血清培养基   因血清所含成分复杂，同时也含有一些不可控因素，细胞毒性物质和抑制物，不仅影响细胞生长和细胞某些功能的表达，有的还会对细胞产生去分化作用，影响一些基础医学研究的结果。因此，一些技术要求和研究目的较高的细胞培养，如细胞生长因子研究和制备、单克隆抗体制备、细胞分泌产物的研究和制备等，都须用无血清培养基，以减少或去除异种蛋白及干扰因素。不仅对产品纯化提取有益，而且可避免异种血清所引起的过敏反应。无血清培养基主要有基础培养基和辅加成分组成，基础培养基一般用人工合成培养基，最常用的是HamF12和DMEM培养基1:1混合。然后补加15mmol/L Hepes1.2g/mL，NaHCO3作为基础溶液。辅加成分有：①促贴壁附着成分，如  纤维粘连蛋白，层粘连蛋白胶原等。②促生长增殖成分，如  一些生长因子和激素。③蛋白酶抑制物，如  大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybean trypsin inhibitor）。    这些辅加成分根据细胞生长条件和实验要求添加。一般先配好储存液，过滤除菌，低温保存，要避免反复冻融。使用浓度和使用方法各不相同。如纤维粘连蛋白的配制浓度为25mg～50mg/L，用时先涂在培养瓶皿支持物上；层粘连蛋白1mg～5mg/L，可直接加在培养液中。成纤维细胞生长因子配制浓度2mg/L，使用浓度5μg /L，可直接加入培养液中；大豆胰蛋白酶抑制剂，使用浓度为0.1%～0.5%，通常配制在基础培养液中。