用非同位素探针进行原位杂交和检测实验-荧光原位杂交

材料与仪器

步骤

1a)石蜡切片或细胞的杂交，对载玻片进行脱蜡、水化、 封闭和脱水处理。将标本晾干（或在干燥器中干燥），随后储于加有干燥剂的载玻片盒中，置-70℃过夜。至关重要的是标本在储放前应绝对干燥。

1b)冰冻切片的杂交：进行切片的预处理和乙酰化处 理，随后进行切片的脱水。标本绝对干燥至关重要，此时切片即可用于杂交（步骤3)。杂交应马上进行。

2) 对每一杂交实验，可用乙醇沉淀10〜15 ng探针，重溶于10μL去离子的甲酰胺中， 加5μg (0. 5μL)超声处理的鲑精DNA,在70°C〜80°C温度下热变性探针10 min。

3) 加10μL主杂交混合液于变性探针中（探针终浓度为0.1〜0.5μg/mL)。混匀，微量 离心机以高速稍加离心，然后加于载玻片上。覆加22 mm2盖玻片，轻压以赶去大的气泡。放入加湿盒中，在37℃温育2〜4h。

杂交也可过夜，若杂交过夜，则用橡皮泥封住盖玻片。

4) 杂交最后30 min期间，以37℃水浴，在Coplin广口瓶中，预热50 mL 50%甲酰胺/ 2×SSC 洗液和 50 mL 2×SSC。

5) 从加湿盒中取出载玻片，剥去橡皮泥（如有使用的话）并小心移去盖玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2 × SSC中，清洗杂交过的玻片15 min；接着以37℃ 2 × SSC洗15 min；再于室温以1×SSC洗15 min。

6) 玻片在室温下，以4×SSC平衡5 min。取出载玻片吸去残余缓冲液，在此过程中任何时候都不要使玻片干涸。

7) 加50μL生物素检测液、地高辛检测液或生物素/地高辛检测液于杂交过的载玻片上。用22 mm2大小的Parafilm覆盖，放在一用铝箔包裹的加湿盒中，于37℃温育 45 min。

8) 室温下，按顺序在裹以铝箔的Coplin广口瓶中，分别用4×SSC、0.1% Triton ×- 100/4×SSC和4×SSC浸洗切片。每种溶液中浸洗10 min。

9) 加50μLDAPI或碘化丙锭染色液于切片上，以一块22 mm2的Parafilm膜覆盖。室温下染色5 min。在盛有1×SSC的Coplin广口瓶中短暂浸洗，以除去多余染液。吸去残液但不要使切片干涸。

10) 加7μL适当的防褪色固片介质于已染色的切片上，覆以盖玻片。轻轻挤压除去多余的防褪色固片介质，注意勿损伤组织切片。以指甲油密封盖玻片，放在有干燥剂的玻片盒中，储于-20℃。

11) 用具落射光源以及有适合实验中所用荧光染料滤光片的荧光显微镜，观察实验结果。

12) 用Ektar-1000(用于打印）或EktachronnHtOO (用于载玻片）彩色感光片照相。 曝光时间依杂交信号亮度而定，但对DAPI的曝光时间为2 s，经双光区或三光区滤光片设施的 曝光时间分别为30〜90 s和3〜8 S。对亮的杂交信号可用黑白感光片，如用Kodak Technical Pan 2415 ASA 200感光片进行曝光。

注意事项

注意：实验用水须以DEPC处理，所用溶液的配制均使用DEPC处理过的水，以抑制RNA酶活性。