谷丙转氨酶的活性测定实验-显色法

血清谷丙转氨酶（SGPT）能催化丙氨酸与酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸在酸性条件下与2，4-二硝基苯肼可缩合成丙酮酸二硝基苯腙，该腙在碱性条件下呈现出橙红色，呈色深浅符合比尔定律，在520 nm处有最大吸收。SGPT 在肝脏中含量最高，由于肝细胞损害，该酶逸出血液，可使 SGPT 含量明显增高。因此测定血清谷丙转氨酶的活性可作为肝中毒肝病的重要指标。

材料与仪器

丙酮酸
丙酮 α-酮戊二酸 dl-丙氨酸 2 4-二硝基苯肼 氢氧化钠
恒温水浴锅 722S分光光度计 吸量管 试管 试管架

步骤

溶液配制：
1. 丙酮酸标准溶液：准确称取22 mg纯净丙酮酸钠，用pH 7.4磷酸缓冲液定容至100 ml。
2. SGPT底物溶液：准确称取α-酮戊二酸87.6 mg，dl-丙氨酸5.34g，先用90 ml 0.1  mol/L pH7.4的磷酸缓冲液溶解，然后用20%NaOH溶液调至pH7.4，再以上述磷酸缓冲液稀释至300 ml，冰箱保存可用一周（加氯仿防腐）。
 
3. 0.1 mol/L pH7.4的磷酸缓冲液。
 
4. 2，4-二硝基苯肼溶液：称取19.8 mg2，4-二硝基苯肼，置于100 ml容量瓶中，先用8 ml浓盐酸溶解后，再加水稀释至刻度。
 
5. 0.4  mol/L氢氧化钠溶液。
操作步骤：
1. 标准曲线的绘制：取干燥洁净试管6支，编号，按下表所示添加试剂。
 
 

向每管加0.5 ml2，4-二硝基苯肼，再保温20 min，分别向各管加入0.4 mol/L氢氧化钠溶液5 ml，室温下静置10 min后，用蒸馏水调零点，于520 nm处测光密度。以各管光密度减去空白管光密度为纵坐标，丙酮酸微克数为横坐标作标准曲线。
 
 
2. SGPT活力测定：取洁净干燥试管4支，即测定管、对照管各2支，按下表添加试剂。
 

 
各管反应完毕，混匀，室温下静置10 min后，再以蒸馏水调零点测定光密度。由标准曲线上查得丙酮酸微克数，根据下式计算SGPT 的活力：SGPT 活力（单位）=（测定管微克数-对照管微克数）/2.5×0.1。
 

注意事项

1. 在呈色反应中，2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙，底物中α-酮戊二酸可与之发生反应，生成α-酮戊二酸苯腙。故制作标准曲线时，需要加入一定量的底物以抵消α-酮戊二酸的影响。
 
2.在测定 SGPT 活力时，应事先将底物、血清在37 ℃水浴中恒温，然后在血清管中加入底物，准时计时。
 
3.标准曲线上数值在20～100 U是准确可靠的，超过200 U 时，需将样品稀释。
 
4.丙氨酸应使用 DL-型，不使用 D-型。如使用 L-型，用量减半。
 
5.溶血标本不宜使用，因血细胞内转氨酶活力较高，会影响测定结果。