组织的分离实验-EDTA 消化分离法

EDTA是一种非酶性消化物，常用不含Ca2+和Mg2+的BSS 配成0.02%的工作液。
关于EDTA的作用机制一般认为是：一些组织，尤其是上皮组织，在生存中需要Ca2+和Mg2+才能维持组织的完整性。EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子，形成螯合物，能促进细胞相互分离。
EDTA 作用比胰蛋白酶缓和，很少用于单独消化新鲜组织（传代细胞可单用），如与胰蛋白酶按不同比例相混合并用，消化作用更好。EDTA 最适消化传代细胞，也多与胰蛋白酶混合使用（1：1 或2：1）。

材料与仪器

营养液
EDTA 胰蛋白酶 Hanks
恒温箱 吸管

步骤

用ETDA 和胰蛋白酶混合消化法传代的过程如下
1.  吸出培养瓶内营养液，注入EDTA（0.02%）和胰蛋白酶（0.25%）混合液（1：1），注入量以能覆盖细胞为度，置37 ℃温箱或室温中作用3 分~5 分钟。
在消化过程中，要在镜下随时监视细胞状态，当见到细胞胞质回缩，胞体趋于变圆，细胞相互间缝隙变大时，便立即终止消化。
细胞上述变化在已连接成片的细胞最为明显；可见细胞由于胞质回缩，而相互分离，遂失去原来紧密接触关系，出现明显可见的缝隙。如消化过度则细胞能完全从瓶壁脱落，这时需要做离心分离以防细胞丢失，增加了麻烦；
2.  吸出消化液，注入适量Hanks液洗一二次；注意注入时要缓慢，不要让液体直接冲刷细胞多的部位，朝向瓶底或瓶角部为好，以避免把细胞从瓶壁上冲下来，然后手持培养瓶轻轻晃动，让Hanks液体在细胞面上来回流动，以洗掉残余的消化液，不要用力过猛，否则能把附着不牢的细胞冲掉，减少细胞数量；
3.  吸出Hanks液，加入适量培养液后，用吸管吸、吹营养液，反复轻轻吹打瓶壁上细胞，使之脱落入培养液中形成细胞悬液。

注意事项

1.  使用EDTA处理细胞后，因血清对其无中和作用，一定要用Hanks液产中洗液，因残留在培养液中的EDTA对细胞能产生不良作用。