pH 值、温度、抑制剂对蔗糖酶活性的影响-二硝基水杨酸法

酶的活性和稳定性易受环境pH 的影响。通常各种酶只在一定的pH 范围内才表现出活性，各种酶在特定条件下都有它各自的最适pH。
温度对酶的作用具有双重影响，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。
抑制剂与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，引起酶活力下降。抑制剂与酶结合分为可逆与不可逆抑制剂。可逆抑制剂与酶是通过共价键结合，不能用透析等物理方法解除。

材料与仪器

蔗糖
磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 柠檬酸 乙酸钠 脲 乙酸缓冲液 葡萄糖 二硝基水杨酸
分光光度计 水浴锅 试管 保鲜膜

步骤

【实验方法】
 
自行设计。
 
【方案举例】
 
实验方法 1:
 
1. 按下表配制12 种缓冲溶液(公用)。
 
将两种缓冲试剂混合后总体积均为10 ml，其溶液pH 值以酸度计测量值为准。
 
2. 准备二组各12 支试管， 第一组12 支试管每支都加入0.2 ml下表中相应的缓冲液， 然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用H2O 稀释， 酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6～1.0 的光吸收值（A650） ）。另一组12 支试管也是每支都加入0.2 ml下表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8 ml。
 
3.  所有的试管按一定时间间隔加入0.2 ml 蔗糖（0.2 mol/L）开始反应， 反应5 min后分别加入1.0 ml 0.2 mol/L NaOH 终止反应， 接着加入1 ml 二硝基水杨酸试剂， 用保鲜膜包住试管口并刺一小孔，在沸水浴中煮5  min，取出速冷，然后加入5.0 ml 水，摇匀测定A520。
 
4. 本实验再准备二支试管， 一支用水作空白对照; 另一支作葡萄糖标准管。
 
5. 画出不同pH 下蔗糖酶活性（μmol/ min）与pH 的关系曲线，注意画出pH 值相同， 而离子不同的两点， 观察不同离子对酶活性的影响。
实验方法2:
 
本实验要测定0～100 ℃之间不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。包括冰水浴的0 ℃、室温(约20 ℃)、沸水浴的100 ℃和不同的水浴温度:10 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃。
 
每个温度准备2支试管，一支加酶，测酶催化，1支不加，以乙酸缓冲液作为酸，测酸催化。
1. 确定酶的稀释倍数，试管中加入0.2 ml 0.2 mol/L，pH 4.9的乙酸缓冲液，0.2 ml稀释的酶，加水至0.8 ml，加入0.2 ml 0.2 mol/L的蔗糖开始计时，在室温下反应5 min分别加 入1.0 ml 0.2 mol/LNaOH 终止反应，接着加入1 ml二硝基水杨酸试剂，用保鲜膜包住试管口并刺一小孔，在沸水浴中煮5 min，取出速冷，然后加入5.0 ml水，摇匀测定A520。 
2. 测定上列各个温度下的反应速度，每次用2支试管，均加入0.2 ml乙酸缓冲液，一支加0.2 ml酶，另一支不加酶，均用水调至0.8  ml，放入水浴温度下使反应物平衡30 s，加入0.2 mol/L蔗糖0.2 ml，准确反应10 min，立即加入1.0 ml 0.2 mol/LNaOH终止反应，按规定进行操作，测定各管A520值，记录每个水浴的准确温度。 
3.酶催化的各管A520值均进行酸催化的校正。分别画出酶催化和酸催化的反应速度对温度的关系曲线和lnk-1/T的关系曲线，用二条lnk-1/T关系曲线的线性部分计算两种活化能。
实验方法 3 :
 
1. 判断可逆与不可逆抑制的实验可选做。 

2. 不含抑制剂(脲)的实验，可用实验(七)的数据，但必须用同一稀释倍数的酶，也可以重做，注意酶浓度要大些。

 
 3. 含脲抑制剂的实验可参照表2设计实验方案。共做三种抑制剂浓度[I]的实验，即分别为加4 mol/L的脲0.10 ml、0.20 ml和0.30 ml（注意:此时要分别少加H2O 0.1 ml、0.2 ml和0.3 ml），仍为12支试管，每支试管都要加脲，第9、第10两管仍为校正酸水解。第11、第12标准管也要加脲，以消除脲对显色的影响。 
4. 画出反应速度与底物浓度的关系图，和I/V-I/[S]关系图，计算Km、Vmax、KI和相应的表观值，讨论脲对蔗糖酶活性的影响。