猪甲状腺细胞原代培养方法

1、材料

猪甲状腺由锦州市屠宰场提供。F-12培养基（sigma公司）；胎牛血清（天津血液研究所）；胰蛋白酶（sigma公司）；胶原酶Ⅳ（sigma公司）；牛TSH（sigma公司）

2、方法

杀猪后迅速取出甲状腺1～2个，置于盛有75％酒精的烧杯中，用冰盒送至实验室（1小时以内）。立即置于pH为7.4的PBS缓冲液（含青链霉素）中，反复漂洗，直至漂洗液清澈透明。去除包膜及结缔组织，用眼科剪子、镊子将甲状腺组织剪成１mm3大小的碎块。

置含0.25％胰酶和300U/ml胶原酶的容器中，放于37℃温箱中消化60min，每隔15min需摇动一次。用吸管将上清液的三分之二吸入离心管中，并加入含有胎牛血清的培养基终止消化。以1000转／分钟离心10分钟后，弃上清。

将细胞沉淀用F-12培养基制成细胞悬液，充分吹打并用不锈钢网（200目）过目，再1000转／分离心10分钟，弃上清。沉淀悬于含15％胎牛血清和１U/L牛TSH的F-12培养基中，台盼蓝染色证明活细胞数大于95％，调整细胞浓度接种于培养板中（１ml／孔）。置于37℃的5％CO2孵箱中，每二至三天换一次液，至细胞融合成片后用于实验。

3、结果

猪甲状腺细胞培养24小时，镜下细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形。

4、讨论

胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织如上皮组织、肝、肾等，对传代细胞也非常好。但消化纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胶原酶对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。

由于甲状腺富含纤维性组织，所以甲状腺的消化分离一般采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法，用单一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲状腺激素（TSH）是培养甲状腺细胞必备的，它能够起到促进甲状腺细胞生长的作用。本人也曾尝试过不加TSH，与加TSH对比明显可见细胞增长较慢，且形态不好。