纯化学定义、无异源动物成分的人多能干细胞(hPSC)培养基

背景 细胞的多能性被定义为一个干细胞能够分化成除了胚外组织（如胎盘）的身体所有类型的终末成熟细胞的能力。这种多能性随着多能干细胞分化为终末分化细胞的逐级分化过程中而逐渐丢失 [1]。两个众所周知的多能干细胞是胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPS） [1]。

在 1981 年，第一个分离并培养的多能干细胞是胚胎干细胞，来源于正在发育的小鼠胚胎的内细胞团（ICM）[2]，这些细胞能够无限增殖并保持基因稳定。人类胚胎干细胞出现于 1983 年 [3]，这使干细胞研究推向新的高度。随后，胚胎干细胞的研究以惊人的速度发展，促进了细胞和发育生物学研究的重大进展 [8]。现在，来源于多种种属的多能干细胞已经成为各种生物工具，如定向分化成各种细胞类型、基因打靶和转基因动物的研究 [8]。更重要的是，其无限的自我更新能力和定向分化为其他类型细胞的能力，是治疗目前很多无法治愈疾病的新希望。

在 2006 年关于小鼠 [12] 和 2007 年关于人 [9,10] 的干细胞研究文献描述中，诱导多能干细胞（iPS）能通过人为重编码成熟体细胞返回多能状态而产生。其原理是通过各种技术诱导不同多能性基因的表达 [11]。这项优雅的革新技术，避免了胚泡来源的人胚胎干细胞 （hESC）的伦理道德问题，为病人特异性干细胞和疾病模型的产生开辟了新的可能性。表面上看，iPS 和 ESC 有很多共同的特征，如形态学、多能性和标志物的表达；然而，详细分析发现，iPS 和 ESC 有基本的不同，如表观遗传学的变化、DNA 甲基化（印迹）和体细胞时期积累的突变 [4]。 需要指出的是，多能性细胞也可以直接从外胚层细胞或间接从单能子代细胞、原始生殖细胞（PGC）得到，通过体外去分化为多能的胚胎干细胞（EGC）。另外，很少有用体细胞核转移（SCNT）和细胞融合 [1] 技术使成熟体细胞返回到多能状态的。SCNT实现重编码过程是通过将体细胞核转移到去核的卵母细胞，用这项技术能够产生一个全功能的胚胎，有时用于克隆动物如「多利羊」（生殖性克隆）[5]，但也可用于建立病人特异性的多能性干细胞（「治疗性克隆」）。

最后，通过多能干细胞和体细胞融合能够产生四倍体或多倍体多能细胞杂合体。 尽管多能干细胞有意义非凡的治疗潜力，但是目前科学上还没有以多能干细胞为基础的治疗安全性和有效性的完整性报告。然而，这些细胞本身的无限增殖能力正是其在广泛治疗应用的主要障碍：残留的多能干细胞有发育为癌症／肿瘤的高风险，目前还没有安全的技术来避免细胞杂质造成的危险 [4]。此外，即使培养过 15 年的人类胚胎干细胞，也经过优化的分化方案，但能够用于移植的功能细胞仍然很少 [6]。

PSC 的多能性，可以通过多种直接或间接的方法进行评估。评估动物细胞多能性的金标准是能够产生嵌合体和分化为各种组织包括种系转移 [13,14]。对于人多能干细胞的多能性，由于伦理道德原因，不能进行严格的测试。然而，可用间接方法对人PSC 多能性进行检测 [13]（如在免疫缺陷小鼠中畸胎瘤的形成或胚状体分化为三胚层），但这些方法费力、昂贵和耗时，并且具有技术挑战性。另外，对多能性标志物的检测（如 Oct-3/4, Nanog, SSEA和Tra）现在也是广泛接受的多能状态的间接证据 [7]。事实上，到目前为止，还没有技术最终能验证现有 HPSC 的多能性确切存在。

在 PSC 起初的研究中，胚胎干细胞通常培养在滋养层细胞上，主要是小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），用的是含 FCS 的培养基[8]。后来，FCS 能够被成分明确的血清替代品替代。细胞外基质包被支持物的引入，使 ESC 的自我更新不再需要滋养层细胞的支持。然而，其培养过程仍然费时、费力、培养基内因子不能完全确认。 近年来，PSC 的培养技术有了显著的进步。纯化学定义的培养基（紧随无异源成分的培养基）已经成为 PSC 培养的标准，然而，所有这些培养基系统仍然需要依赖成分不完全明确的、异源的、难标准化的细胞外基质（ECM），这也是用化学定义/无异源成分培养基的矛盾之处。事实上，科学家最近刚克服了这一问题，天然合成的 ECM 分子和多肽也能支持 PSC 的生长。现在科学家能够完全用化学成分明确的培养基诱导、培养 hPSC。 虽然这些技术都在进步，建立 hPSC 培养系统仍有以下一个或多个不利因素：

● 使用超过生理水平的大量的生长因子 ● 含有人源或动物源性物质 ● 依赖动物来源的或成分不完全明确的 ECM PromoCell hPSC 生长培养基 DXF 消除了这些不利因素，不仅是纯化学定义/无异源性的，也完全不含有人源或动物源性物质。此外，培养基中添加的生长因子的浓度在较低的生理范围内。最佳的培养环境是生长过程易于控制的、稳定的、可重复性的，支持细胞的多能性和提高克隆效率。和细胞外基质 hPSC-ECM DXF、hPSC 分离缓冲液 DXF，PromoCell 提供了 hPSC 的纯化学定义和无异源成分的完全培养系统。hPSC-ECM DXF 是化学定义的无异源成分被广泛应用的细胞外基质。非酶促反应的无异源成分的hPSC分 离缓冲液 DXF 能够温有效地作用于 hPSC，用于细胞的传代。 使用无菌操作和层流工作台 人类多能干细胞培养方案Ⅰ. 实验材料和培养基/溶液

● hPSC 生长培养基 DXF● hPSC 分化缓冲液 DXF● hPSC-ECM DXF，20x 浓缩● Dulbecco PBS，无 Ca++/Mg++冻存 hPSC 细胞复苏或单细胞传代培养的需求：● Y-27632 (PK-CA577-1596-1) 或二者择其一● Thiazovivin (PK-CA577-1681-1)

Ⅱ. 培养指导 该培养方案描述了 PromoCell 的 hPSC 生长培养基 DXF 转换目前培养的步骤。确保细胞培养状态良好。多潜能性最佳结果，应该≥90%。 1. 培养瓶包被 ECM hPSC-ECM DXF 的已解冻 ECM 原液，使用无 Ca++/Mg++ 的 Dulbecco PBS 溶液以 1:20 的比例稀释。密封的组织培养瓶内每cm2 的培养表面，使用 100 μl 稀释的 ECM 溶液，并在室温下作用 2 h。确保 ECM 溶液完全覆盖容器表面。如果不立即使用，密封容器在 2~8°C 可以存储多达 7 天的时间，推迟使用。在接种细胞之前，吸出 ECM 溶液。稀释的 ECM 溶液，在 2~8°C 可以储存 2 个星期，避光保存。 注：为了获得最好的结果，PromoCell 推荐使用 Hpsc-ECM DXF。当然，其它既定类型的适当 ECM 也可以使用。 2. 准备 hPSC 完全生长培养基 DXF 在室温下，融化混合补充剂，或者在手中混合融化。确定溶液中无沉淀物留下。通过向基础培养基中添加已解冻的无菌混合补充剂，准备 hPSC 完全生长培养基 DXF。轻轻旋转获得混合均匀的溶液。 注：请在 10 天内使用 hPSC 完全补充生长培养基 DXF。使用时，预热一部分的完全培养基，剩余的完全培养基保存在 2~8° C，避光保存。 3. 细胞铺板（0 天） 目前的增值培养实行一个成群的传代，如下面步骤Ⅲ.A.所描述的，以 1:2~1:3 的比例接种细胞到 ECM 包被的组织培养瓶，使用适量的hPSC生长培养基DXF。例如，6孔培养板中2~3ml/孔，T-75培养瓶中使用15~25ml。对于冷冻保存的细胞，向融化的培养基和中添加ROCK-抑制剂（10μM，Y-27632 或2μM，Thiazovivin），hPSC生长培养基DXF也要添加。 注：hPSC对PromoCell hPSC生长培养基DXF的适应不是必须的。 4. 细胞附着、贴壁 接种后，让传代培养的细胞过夜（12~24 h）贴壁。 5. 更换培养基（1天） 完成培养基更换：抽出培养基包括没有附着的细胞，使用 Dulbecco 无 Ca++/Mg++ 的 PBS 洗涤一次，给细胞提供新鲜的 hPSC 生长培养基 DXF（ROCK- 抑制剂）。 注：不要添加 ROCK-抑制剂。 6. 细胞扩展（1+天） 每天都要更换培养基。让细胞扩展到单个克隆互相接触（一般 4~7 天），或者细胞克隆显示最初的分化征兆，这种分化由克隆的大体积所诱导。着手进行步骤Ⅲ，细胞的传代培养。 注：适用于既定的 hPSC 培养，hPSC 生长培养基 DXF 维持扩展饲养周期长达 48 小时，作为例外。然而，这在培养起始阶段不推荐。PromoCell 的 hPSC 生长培养基 DXF 能够挽救分化培养。实行 1:1 比例细胞团传代（见步骤 Ⅲ.A），2 天更换一次培养基直至分化的细胞消失，同时细胞/克隆的形态学正常。Ⅲ.hPSC细胞团或单细胞传代培养 A.细胞团传代（推荐常规培养） 1. 吸出培养基，用 Dulbecco 无 Ca++/Mg++ 的 PBS 洗涤细胞 2 次。 2. 加入 200~300 μl/cm2 的 hPSC 分离缓冲液 DXF，在培养箱中，37°C 和 5% CO2 条件下孵育 6 分钟。 注：其他既定酶的解离/传代培养操作也能使用。 3. 小心吸出分离缓冲液，加入 1~5ml 的新鲜 hPSC 生长培养基 DXF。使用血清吸管，冲洗克 隆离开培养表面。冲洗避免超过 4~5 次，以便维持细胞团一定的大小。 4. 新鲜的 hPSC 生长培养基 DXF 混匀细胞团，加入到到新的 ECM 包被的培养瓶中。 5. 根据细胞附着步骤Ⅱ.4操作进行。 B.单细胞传代 1. 吸出培养基，用 Dulbecco 无 Ca++/Mg++ 的 PBS 洗涤细胞 2 次。 2. 加入 200~300μl/cm2 的 hPSC 分离缓冲液 DXF，在培养箱中，37°C 和 5% CO2 条件下孵育 6 分钟。 注：其他既定酶的解离/传代培养操作也能使用。 3. 吸出分离缓冲液，替代以 50~100 μl/cm2 的新鲜 hPSC 分离缓冲液 DXF 补充 ROCK-抑制剂（10 μM，Y-27632 或 2 μM，Thiazovivin）。 4. 使用血清移液管多次冲洗培养表面，除去细胞。来回抽吸液体，分散细胞，额外操作 5~10 次。 5. 离心单细胞悬液（5 min,200 Xg,室温）。 6. 吸出、去掉上清液；悬浮在新鲜 hPSC 生长培养基 DXF 中的细胞，补充 ROCK-抑制剂（10 μM，Y-27632 或 2 μM，Thiazovivin）。 注：二者择其一，选择在缓冲液中混匀细胞，在你的实验中使用它们，例如：流式细胞分析的免疫染色。 7. 将细胞接种在ECM包被的容器中，根据步骤Ⅱ.4进行细胞附着。

细胞在 PromoCell 的 hPSC 生长培养基 DXF 中培养了 17 代，使用 PromoCell 的 hPSC-ECM DXF 作为一种细胞外基质。传代培养是通过细胞团传代来完成的，同时使用 PromoCell 的 hPSC 分离缓冲液 DXF。98% 以上的培养细胞，标记人多能性 Oct-3/4 和SSEA-4，染色呈阳性。97% 以上的细胞 SSEA-1 为阴性，SSEA-1 为人多能性干细胞分化标记（不显示）。 hPSC 生长培养基 DXF 已通过检验的人类多潜能干细胞的新培养体系 （PromoCell，c-28060）:

● 极好的支持多潜能性● 显著的克隆率● 低于生理水平的生长因子● 纯化学定义、无异源● 无人/动物来源的成分

参考文献

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