大鼠心室肌微血管内皮细胞的原代培养

材料和方法

1、仪器：

手术器械一套，倒置显微镜（Leica）,CO2细胞孵育箱（Heraeus），超净工作台（苏州净化设备有限公司），扫描电子显微镜（Hitachi）。

2、主要试剂:

DMEM高糖培养基（Gibco），胎牛血清（Hyclone，杭州四季青生物工程材料公司），胰蛋白酶、EDTA（Ameresco）；小鼠抗人CD105单克隆抗体（NeoMarkers），兔抗人CD34、CD31多克隆抗体（Antibody Diagnostica Inc），兔抗人vW因子多克隆抗体（华美公司），抗兔及抗鼠ABC试剂盒、DAB显色试剂盒为华美公司产品，其他试剂均为国产分析纯以上级别。

3、方法:

植块法原代细胞培养：

细胞培养瓶的处理：选用50ml玻璃培养瓶，高压蒸汽灭菌，瓶底铺自制鼠尾胶（制作方法参见2），移入80℃烤箱烤干，临用前用消毒D-Hanks平衡盐缓冲液冲洗3次。

选用80克SD大鼠（雌雄不限，购自复旦大学实验动物部），1%戊巴比妥钠（1ml/100g）腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡5min消毒，将大鼠移至超净台进行操作，止血钳固定四肢，逐层打开胸腔，暴露心脏，剪开心包，由升主动脉处剪下心脏，放入D-Hanks平衡盐缓冲液中.

冲净心腔中的血液，辨清心脏解剖结构，去除大血管、左右心房以及右心室和室间隔，保留左心室，小心去除心内膜及心外膜，用眼科剪剪碎余下的心室肌约2mm见方，滴加1ml进口胎牛血清.

均匀接种于处理过的50ml培养瓶中，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞孵育箱静置培养，使其贴壁，4小时后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培养液4.5ml/瓶，约48小时后组织块周围有星形细胞长出.

80至96小时组织块周围有大量细胞长出，去除组织块，继续培养36-48小时，待细胞汇合铺满瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化细胞进行传代，取用第二代细胞进行进一步鉴定和实验。