差速贴壁纯化心肌细胞的相关问题

开始时，我的细胞用胶原酶消化5h接种玻璃培养瓶，1.5h后吸出细胞液至另一培养瓶培养以去除成纤维细胞，原瓶内成纤维细胞加培养液继续培养，24h观察，发现转瓶后心肌细胞未贴壁，培养液中为大量细胞碎片状东西以及未贴壁的细胞悬浮，仅见极少量的成纤维细胞贴壁生长，接种24孔板也是这样(24孔板为新，非重复使用)，接连几次都是这样，很是郁闷。

而原瓶内分离的成纤维细胞生长良好，且可见少量心肌细胞贴壁成团生长，有搏动，一直疑惑不解什么原因导致转瓶后细胞贴壁失败。经过将近一个月的摸索，终于发现问题所在了！ 写出来跟大家共享：

转瓶后心肌细胞不是不贴壁，而是没有活细胞可以贴壁了！我尝试在不同时间转瓶，发现15min时就已经有很多心肌细胞贴壁了，而且是活力比较好的心肌细胞。我将原瓶继续培养，结果长出了不少心肌细胞，搏动也很好，正说明了这一点。

文献上说的是1.5-2h转瓶，其实这时很多活力好的心肌细胞已经贴壁了，吸出来的上清只有细胞碎片和活力不太好的心肌细胞。所以我建议缩短转瓶时间，或者转瓶时将原瓶轻轻冲洗一下。有什么问题也可以一起讨论。

网友zhangpian问：我也遇到了同样的问题，用的是0.125%胰酶冷消化过夜，之后再用0.125%胰酶消化两次，每次约8分钟，含10%胎牛血清DMEM终止消化，1000转，8分钟离心，差速贴壁90分钟，两天后发现心肌细胞基本不贴壁，成纤维细胞长得比较好，今天刚换了液，剩下的心肌细胞就那么一点点，还都是接近圆形的，不知道是胰酶浓度过高还是离心转速和时间太过？还在养，不知道心肌细胞能不能活。

答：你的情况的确跟我以前相似，建议你下次再取原代心肌时试试缩短差速贴壁的时间，看看心肌细胞是否贴壁多些，或者把原瓶加培养液培养，看是否有很多心肌细胞生长，这样就可以找到原因了。我没有试过胰酶冷消化过夜，但个人认为可能对心肌细胞损害有点大。我用的离心速度跟你一样，应该没什么问题。

网友zhangpian问：原瓶里的细胞长得还可以，如何区分原瓶里的心肌细胞和成纤维细胞？因为看文献都说是一到一个半小时贴壁。下次我试试缩短差速时间。

答：倒置显微镜下心肌细胞和成纤维细胞不太好区分，实在想证实可以做免疫组化，但是搏动的细胞肯定是心肌细胞。