心肌细胞的分离及培养

器械：

饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒

溶液：

PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶

动物：

小鼠

准备：

用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。

培养过程：

1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。

2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。

3、PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。

4、放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。

5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。

6、重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。

7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。

8、加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。

9、培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。

10、显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。

11、4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。

或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。