淋巴细胞转化

实验步骤

采血：

需要在严格无菌条件下采血。肝素抗凝，室温保存，24hr-72hr转化效率高。也有保存更长时间，采血后不要将血液置冰箱中，长途运输也不要冷藏。

分离淋巴细胞：

采集血液4-5mL，与2mL1640（含1%双抗）在离心管内混合，然后缓慢沿管壁注入淋巴分离液（已37℃预热），3000rpm离心30min。

收集白细胞层，转移至另一离心管中，加入10mL1640（含1%双抗），轻轻吹打均匀，1500 rpm离心15min。弃上清，如此反复洗涤3次，收集白细胞。

转化

取1 mL全培养基（+0.5%pHA）加入已经洗涤三次的白细胞离心管中，轻轻吹打均匀，转入24孔板中，加入自备EBV液0.6mL，20ug/ mL环孢霉素0.2 mL，放入37℃5%CO2培养箱中培养。

3-4天后观察细胞，镜下可见集合的细胞团，以及已被转化的明显增大的类淋母细胞，4-5天后可加入0.5 mL全培养基（1640+15%FBS+1%双抗+1.6%1M Hepes），然后视细胞生长情况更换培养基，并且转入培养瓶中。

附：

EBV液制备：

培养B95-8细胞，待细胞长满，培养基变黄，收集于50mL离心管中，于-80℃冰箱中，过夜，37℃水浴融化，再置于-80℃冰箱中，如此反复冻融三次，2000 rpm离心20min，上清0.2um过膜，-80℃冰箱中冻存备用。