原代培养结肠平滑肌细胞
实验步骤(一)、取SD 大鼠一只,实验时断椎处死。(二)、在无菌条件下快速自肛门上2 cm 取结肠10 cm 左右,生理盐水中反复灌肠冲洗。(三)、移入含300
实验步骤
(一)、取SD 大鼠一只,实验时断椎处死。
(二)、在无菌条件下快速自肛门上2 cm 取结肠10 cm 左右,生理盐水中反复灌肠冲洗。
(三)、移入含300 U/ml青霉素、300 U/ml 链霉素的HepesRinger缓冲液中浸泡,肠段内外各15 min。
(四)、将经抗生素浸泡过的肠段移入含Hepes Ringer缓冲液的塑料培养板中(培养板预先铺上705胶),在体视显微镜下沿肠系膜对侧纵行切开肠段,皮内针固定好四角,仔细地刮除粘膜层,翻转至外侧,小心地撕去肠系膜,再仔细地刮去浆膜层。
(五)、反复用镊子侧角刮肠段的内、外层,直至余下的组织层在体视显微镜下观察到呈透明的一层为止。将组织层剪碎匀浆,加入到4 ml 含0.1% Ⅱ 胶元酶和0.01% 大豆胰蛋白酶抑制剂的消化液中,30 ℃ 恒温水浴震荡20 min,离心,弃消化液。
(六)、再加入6 ml消化液,30 ℃ 恒温水浴震荡30 min,加对倍缓冲液中止消化,用滴管反复轻柔吹打。
(七)、1000 r/min离心5 min,用10 ml DMEM 培养液重悬细胞。
(八)、过100目细胞筛网,取细胞滤液用Trypan 蓝染色检查细胞活性,确认活细胞在90% 以上。
(九)、用DMEM 培养液将细胞浓度调整至5×104/ml,接种至培养瓶中,放入培养箱内,37℃ 95% O2 和5%CO2条件下培养。
(十)、细胞培养24 h 后换液,弃去未贴壁细胞,加入培养液继续培养,以后每3~4 天换液1次,期间用倒置显微镜观察细胞生长情况。细胞培养14 d 后,细胞可长成致密单层,即可传代培养。