细胞被污染了，你发现了么？

用好的血清，细胞一定状态良好？养细胞细心、体贴像照顾小孩纸，细胞一定「平平安安」？但 MTT 等一些细胞实验结果却异常。因为你的细胞已悄悄被支原体污染了。

支原体是一种生命力顽强的细菌，它和其他细菌的区别在于，支原体没有细胞壁，只有柔软的细胞膜。娇小的身材（0.15-0.3μm）让它可以轻松穿过滤器。

由于身形小，培养物不会表现出浑浊或其他明显可见的特征，因此支原体很容易被忽视。但支原体其实已经随着操作者的操作「偷偷地」潜入超净工作台，并附着在血球计数器、移液器、废液缸等物体表面。常见的支原体污染来源有：1. 受污染的培养基、血清、或试剂2. 不彻底的灭菌3. 培养箱：目前常见的培养箱都带有通气扇和 CO2 瓶，在开、关内门的过程中，被支原体污染的颗粒会被扰动，可能造成细胞污染。其他实验设备的使用也可能造成污染颗粒的扰动，如移液器、离心机等。4. 液氮液氮也可以成为传播支原体的媒介。支原体具有顽强的生命力，即使没有经过低温冷藏过程，支原体也可以在液氮里存活。在液氮中，支原体虽然不会增殖，但是仍可以污染保存在其中的细胞，因此建议将冻存管保存在液氮罐的气相层中。5. 空气悬浮物在培养过程中产生的悬浮颗粒是微生物污染的最主要来源，一些常见的仪器或普通的实验操作都会产生这些颗粒，例如移液器、真空泵、离心机、冰箱等。携带微生物的颗粒直径多在 4-28μm 之间，在静止空气中，它们以 30 cm/min 的速率移动，因此在密闭、不通风的房间或实验室内，基本不会造成生物污染。

但是，当实验者进入房间时，沉积的颗粒会被扰动，悬浮起来的颗粒则有可能污染细胞。因此严格的无菌操作意识很重要。此外，实验动物也会带来一些被污染的悬浮颗粒。除上述的情况外，滥用抗生素、密封不严、受污染细胞等也都可能是支原体污染的来源。支原体污染的危害：1. 支原体导致细胞密度的减少，并引发细胞不可逆的退化。2. 支原体吸收、破坏培养基中的精氨酸，抑制细胞生长、引发细胞凋亡，造成细胞活性降低、细胞脱落等现象 。更有甚者，也可能导致染色体畸变，因为精氨酸是细胞核内组蛋白的重要成分。3. 支原体对 MTT 有还原作用，因此常规的细胞毒性实验 MTT 实验的结果会受到支原体的严重干扰；某些支原体也可以直接诱导树突状细胞的成熟，这对于人体免疫细胞的肿瘤治疗来说，无疑是一个灾难；除此之外，支原体的存在可以显着改变数百个基因的表达水平。由此可见，支原体不仅影响细胞的健康，也会影响细胞实验的结果。因此，有必要定期检测支原体。建议在引进新细胞、冻存细胞前或发生细胞房污染等情况时，及时对细胞进行支原体检测，平时对正常培养的细胞也有定期检测的必要，以做到及时发现，及时处理，避免更大的损失。防止污染的方法1. 改进无菌技术、严格无菌操作对新进实验室的人员，要由有经验的人员帮带，严格监督其实验操作；此外建议记录每一次的污染事件，以便分析解决污染问题。2. 检测外来细胞因为外来的细胞携带污染很常见，因此，选择可靠的细胞来源非常重要。在没有独立细胞培养箱的情况下，可疑的细胞培养物应培养在带盖的培养瓶中，不要使用培养板或没有密封的培养皿。此外，处理这类细胞应在一天工作都结束后进行，并且使用独立的培养基和试剂，最后还要对超净工作台进行彻底除菌。

其他方面，如减少悬浮物产生、正确使用抗生素、定期进行支原体检测等，对于防止污染也尤为重要。

支原体检测

ExCell Bio 支原体检测试剂盒针对支原体 DNA 用 PCR 检测可疑样本，其中 PCR 引物通常针对支原体的 16S rRNA 基因。在凝胶电泳过程中，支原体 DNA 会显示为特异性条带，以指示支原体的存在。支原体检测试剂盒特点：灵敏度高：能够检测大于 10-20 拷贝的靶 DNA；检测范围广：涵盖 54 种支原体，彻底排查污染；普通 PCR 反应即可完成检测，操作不复杂（TAKARA 用巢式 PCR 法、 lonza 用荧光检测和荧光定量 PCR 等方法，操作复杂）；可排除假阴性：宿主阳性对照，结果更准确

1 号样品：细胞裂解液被污染；上清被严重污染

2 号样品：无污染

3 号样品：无污染；-：阴性对照成立；+：阳性对照成立