一种体外扩增人γδΤ细胞的新方法

在人体发育过程中，γδΤ细胞先于αβΤ细胞出现，γδΤ细胞 主要分布于皮肤，小肠、食道、肺和生殖器官等上皮组织内，而在外周血中淋巴细胞仅占0.5%-5%。

外周血中γδΤ细胞主要为Vγ9Vδ2、δ1Τ细胞，它在抗感染、抗肿瘤和免疫监视以及免疫耐受等方面具有重要的作用，但在其反应机制方面仍然了解不多。

在体外大量扩增Vγ9Vδ2、δ1Τ细胞是研究γδΤ细胞生物学功能和用于临床肿瘤治疗的重要步骤。国内已报告多种γδΤ细胞体外培养方法[1-5]，现介绍一种新的γδΤ细胞体外快速扩增方法。

1、材料和方法

1.1 材料和仪器

RPMI-1640（Gibco公司产品），人AB血清来自徐州市血站，胎牛血清和淋巴细胞分离液购自中国科学院血液病研究所，异戊烯焦磷酸(isopentenylpgrophosphate.IPP)购自sigma公司，IL-2（夏门），抗人TCR-γδ-FITC，抗人CD3Ab-PE，抗人CD44Ab-FITC，均购自杭州联科生物（Immutech,French）,K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞由中国科学院上海细胞所提供，流式细胞分析仪（FACSC alibur.Becton Dickinson），分析软件为CellQuest，每个标本分析细胞数≥1×104 。

1.2 方法

(1 ) γδT细胞的培养 取健康献血者静脉抗凝血100ml，经1500r/min离心15min,再吸取白细胞层约10ml加入淋巴细胞分离液上，以2000r/min离心20min，吸取单个核细胞（PBMC）层，用生理盐水洗涤，1500r/min离心10min，洗涤3次后计数细胞后备用。

将PBMC加入γδT细胞RPMI1640培养液中（含10%小牛血清和5%人AB血清），调整细胞数为1×108/L，置250ml细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，根据细胞生长情况及时添加培养液。

(2 ) TCRγδT细胞鉴定 用抗TCRγδ-FITC、抗CD44FITC和抗CD3PE与培养10天时收集的培养细胞直接染色后进行流式细胞仪检测分析，阴性对照为FITC标记的正常人IgG。

(3) γδT细胞形态学观察 用数码相机拍摄培养2、10天时细胞生长状态和培养10天时的细胞的瑞氏染色后的形态并进行透射式电镜检查。

(4) γδT细胞杀伤活性检测 用本室建立的乳酸脱氢酶释放法测定γδT细胞杀伤活性[6]，以K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞作为靶细胞，按效靶细胞比5:1、10:1、20:1、40:1的比例加入γδT细胞，37℃、50%CO2条件下孵育6小时，收集上清液在全自动生化分析仪（Olympus AU1000）340nm波长下测定光密度（A）。

A实验组－A效应细胞自然释放组 杀伤活性（%）═_____________________________________ ×100%

A靶细胞最大释放组－A靶细胞自然释放组

(5) IPP和IL-2用量确定 参照文献报告我们分别选择IPP浓度分别为0、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 ng/ml，IL-2浓度为100 IU、200 IU、400 IU 和800IU/ml进行正交设计方法培养，最后确定IPP和IL-2使用浓度。