细胞培养方法的问答（2）

1、侵袭实验与转染细胞问题。

问：我要做侵袭实验，但我做的是瞬时转染的贴壁细胞，我想请教各位，瞬时转染后多长时间，可以消化细胞进行transwell小室的细胞接种？

答：最好是24小时，我们科有两个都用二十四小时，但也有文献报道说用48小时。如果是稳定转染，则需要在对数生长期接种细胞。

2、原代成骨细胞培养不贴壁问题。

问：我用新配置的0.25%胰蛋白酶消化骨片30分，然后用胶原酶消化90分，培养24小时后，发现一半贴于壁上，但没有形态变化，另一大半浮于培养液中，36小时一小部分发生形态变化，为什么会发生这种情况？

答：很可能是培养基里血清浓度偏低，细胞就不易于贴壁。

3、大鼠原代肝细胞不贴壁问题。

问：用出生小于三天的大鼠做原代肝细胞，用酶消化法分离细胞，在用1640+FBS来培养。做了几次，可细胞就是不贴壁。是什么原因？

答：可能原因有如下几条：

(1)我们用胰蛋白酶消化，发现贴壁比较困难，因为影响胰蛋白酶消化能力的因素太多，比如浓度、PH、温度、时间等，很难把握好最佳的条件，建议用胶原酶消化，使用浓度为0.2%，过夜消化(10小时左右)。然后过滤接种。

(2)细胞接种密度的问题：我们第一次接种时密度太大，结果三天仍没有贴壁，后来我们用三个六孔板摸索细胞接种浓度，结论是只要不超过10的6次方每ml，一般问题不大。

(3)血清浓度对细胞贴壁也有一定的影响，我们的经验是先用20%的血清(进口可用15%)促进贴壁，待贴壁2天后换用一般生长浓度。

(4)如有条件可加入少量肝细胞生长因子，若没有条件，可搜集其他养肝癌细胞同学细胞培养液的上清液，筛网过滤后(300目)接种也行。

(5)如若楼主使用的的是玻璃培养瓶，建议使用促进细胞贴壁得物质，如多聚赖氨酸，明胶，或用小牛血清(5滴)包被培养瓶过夜。

(6)看看自己得培养箱有没足够的水，保持足够的湿度。

建议用塑料小培养瓶，一次性的那种，细胞更容易贴壁。

4、SOD测定方法的问题。

问：我要测细胞胞浆中SOD活性的变化，用722分光光度计测定，想请教如何处理细胞？是用细胞裂解液还是用超声细胞粉碎器粉碎细胞？还是先裂解液裂解后在超声粉碎？我用细胞裂解液做过，实验趋势出来了，但数值较小，是怎么回事呢？

答：我测过细胞胞浆中的ALP活性，用的是超声细胞粉碎机破碎的细胞，数值还可以。你的数值较小，是否细胞密度小？你测的是比活性吗？有没有测蛋白浓度？

5、问：培养乳鼠心肌细胞需要200目尼龙滤网，怎么消毒？

答：用布包起来高压灭菌，我们用的是不锈钢筛网，放到盒子里跟手术器材一起高压灭菌。也很便宜。

6、抗氧化剂的选择问题。

问：我做细胞共培养实验，想选择一种抗氧化剂来阻断上清中大量的ROS，应该选择那种比较好呢？过氧化氢酶或是超氧化物歧化酶可以吗？

答：我做的是细胞的，用NAC，不过不知道你的上清可以用不。

7、问：成骨细胞功能检测的方法，除了ALP活性和钙结节染色计数还有哪些？

问：我实验最后一步准备检测矿化结节形成量，用钙结节染色计数法，但觉得实施起来难度很大，一是药物很多，检测浓度也很多；二是培养时间长，要18天，3天就要换液一次，工作量太大；三是结果靠目测，不太可靠。请问还有其他检测成骨细胞功能的方法吗？且周期短，实验仪器要求不高。

答：要不你就测细胞内钙离子浓度？测定细胞内钙离子浓度是成骨细胞一个指标啊！该指标可以反映成骨细胞摄取钙的能力。不过一般用得很少，我只见过一篇文章用过。我正在做矿化结节，我有三个药，每个药5个浓度。觉得还行，后面就是换液。