三维细胞培养-支架培养模式

在细胞和组织培养领域，从上世纪70年代起二维（2D）培养科学家已经看到其局限性，并且更多地关注三维（3D）培养的优点，目前越来越多的研究从细胞培养的平面环境中转变到三维培养。当前，虽然对基于细胞的效应研究和毒性测试中，制药工业如今最常用的依旧是2D方式，3D培养技术已在学术研究中被广泛应用。细胞增殖，分化和代谢等生理活动都严重受到微环境的影响。

当前细胞生物学研究大多还是在二维平面培养进行，这种平面培养、生长方式与机体内立体环境差别很大，导致细胞形态、分化、细胞与基质间的相互作用以及细胞与细胞间的相互作用与体内生理条件下细胞的行为存在明显差异。

2D和3D环境下培养的细胞相比较，诸多生理指标都显著不同，例如原代小鼠乳腺管腔上皮细胞(mammaryluminal epithelial cells, MEC)在3D基底膜基质中增殖的时间明显长于2D培养环境；更有甚者，有时药物作用于2D培养的细胞呈现的效应与3D细胞相反。

3D培养可以设计模拟体内的生理环境，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近。随着在生物相关性，通量，产出量等方面的改进，伴随3D培养成本的降低，3D培养在再生医学，基础研究和药物研发中的应用将越来越广泛，一场细胞由2D培养走向3D的变革正在发生。 3D细胞培养-支架三维培养当前市场上有多种类型的3D培养系统，根据产品是否为细胞提供支撑（支架）材料（scaffold）大体可分为两种类型：基于支架（scaffold）的培养体系和无scaffold的培养体系。今天来介绍一下有支架的三维培养体系。一、根据支持物的性质分类，基于scaffold的培养体系可分为天然细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）作为支持材料的3D培养和人造基质作为支持材料的3D培养。 1. 天然ECM作为支持材料的3D培养这种方法以天然ECM作为支持材料，根据培养细胞类型，优化3D培养基质配方，以满足不同组织细胞的培养需求。很多公司都可提供细胞外基质产品用于3D培养，例如TAP Biosystems（已被Sartorius Stedim Biotech收购）的RAFT胶原系统，Matrigel模拟基底膜基质产品；Advanced BioMatrix，Amsbio和Sigma-Aldrich公司也都有细胞外基质凝胶产品。但天然基质材料存在一定病原风险，且材料可能存在批次差别性等缺点。 2. 人造基质作为支持材料的3D培养方法合成的人造基质材料类型相当多，例如Cellendes的3D Life仿生水凝胶材料；3D Biotek公司有多种3D大分子支架材料；Reinnervate公司Alvetex产品用的是聚苯乙烯(polystyrene scaffold)；Life Tech公司的AlgiMatrix 3D培养系统采用褐藻原料；Synthecon和Xanofi的纳米纤维技术平台XanoMatrix采用合成纳米生物基质和培养材料；PuraMatrix采用合成肽水凝胶；其它合成材料产品还包括Lena Biosciences的SeedEZ等。Cellendes的3D Life仿生水凝胶材料可以说是合成的人造基质材料的优秀代表。Cellendes的3D Life仿生水凝胶通过合成大分子材料和交联剂(crosslinker)方式和比例的灵活组合，构建不同的3D细胞培养环境。这种高化学和机械柔性（flexibility）的合成系统赋予了该材料较动物源性支持材料更多的优势。诸多优点使3D Life仿生水凝胶不但是普通3D培养的上佳选项，也使其成为细胞扩散和迁移研究的理想产品。 下文对Cellendes的3D Life Biomimetic Hydrogel System做一简单介绍： 3D 仿生水凝胶系统是一套用于3D细胞培养时构建细胞外基质组分的试剂使用者可以选择不同polymer和crosslinker组合，构成不同的3D细胞培养注： 蓝色：Polymer 绿色：linker 红色：RGD肽 1. polymer 的选择，决定了是否可人为的回收细胞；2. rosslinker的选择决定了细胞是否能够降解局部水凝胶来为自己创造移动空间；3. 加RGD多肽可以为细胞提供可粘附的细胞外环境，这也是绝大多数细胞扩散和迁移的先决条件。3D仿生水凝胶优势及应用1.Life水凝胶系统与活体细胞外基质相似，采用该系统可使体外细胞培养更接近体内的生理特征，是基础研究、药物筛选和再生医学等领域细胞功能研究的理想选择。2.产品组合灵活，操作简单，控制自如。3.对细胞无任何毒害，选择可降解材料，可以轻松回收细胞。4.应用广泛：可用于细胞培养、标记和显微观察等诸多方面；细胞可在凝胶内也可在凝胶表面培养；可活细胞直接观察也可选择原位固定后观察；支持GFP等多种报告基因标记后观察方式；可选择不同类型细胞共培养，更好模拟体内生理状态。 3D life水凝胶中细胞的固定与标记使用小分子物质，例如荧光标记phalloidin，核酸染料，活性和毒性检测试剂，增值检测试剂等小分子物质进行细胞标记方法，除了在孵育时间上适度延长以便能在水凝胶中充分扩散外，与传统的2D细胞培养方式相同。所培养的细胞如果经基因修饰还有荧光蛋白，则可直接用于观测，因凝胶完全透明不影响观测结果。

如果使用抗体等大分子对细胞进行标记则不能直接在水凝胶中开展，因水凝胶的孔径原因，不适合直接抗体标记，需要使用dextranase将细胞从水凝胶中释放出来，如果担心细胞在操作过程中细胞生理活动波动，则可经在凝胶中将细胞固定后在进行操作。 二、如果按支持材料形成的方式分，基于scaffold的培养体系可分为如下两类，一种是将细胞分散在液体水凝胶中，然后通过交联实现3D培养，这类产品代表生产商包括Cellendes, Matrigel, Glycosan Biosystems和QGel等；另外一种是将细胞“播种"在3D基质上，这类方法的代表厂商包括3D Biotek, Alvetex和AlgiMatrix等。第一种方式中的Cellendes产品上面已经做了简要介绍；下面将细胞“播种"在3D基质方法的代表产品3D Biotek给予简要介绍：3D Biotek得益于其精妙的3D微细加工技术和先进的生物制造工艺，产品在干细胞/组织工程、药物研发和细胞生物应用等涉及3D培养的领域处于引领地位。根据用户的不同需求，3D Biotek提供系列的产品和装置，包括多种3D细胞培养的支架材料：例如可生物降解的聚已内酯3D Insert PCL，这种材料已经被美国标准和技术协会(NIST)认定为标准的3D组织培养支架材料；聚苯乙烯3D Insert PS材料。 3D Biotek开发有独有的可直接用于如细胞凋亡和荧光ELISA等荧光和化学发光实验的新材料培养板。3D Biotek还提供可降解生物材料Poly(DL-lactide-co-glycolide) (PDLLGA)。3D Biotek有用于3D肿瘤细胞或干细胞培养(或共培养)的仿生基底膜：3D Insert-PS/PCL (聚苯乙烯/聚已内酯)纳米筛网。高效将质粒转染入3D培养的细胞的3D转染试剂盒(BioCellChallenge, SAS)。多种3D Biotek专利技术制造多孔聚合物支架材料填充的3D生物发生器（3D Bioreactor），即包括可生物降解聚合物(polystyrene, PS)也包括不能生物降解聚合物(polycaprolactone, PCL)类型。各种预填充了孔状3D Insert™支架材料的塑料装置，如3D Insert™PS (聚苯乙烯)支架，3D Insert™PCL (聚已内酯)支架，3DKUBE™等。用于骨组织工程中常用的可完全吸收的生物陶瓷材料B-TCP盘(Disc)，用于骨质疏松症，骨基质矿化，组织钙化和骨修复等各种骨相关研究的HA盘(Disc)等。选用3D Biotek产品能获得高的细胞培养效率；增加细胞因子、抗体和其它生物分子的产出量，且生成的细胞因子、抗体等易于分离；减少动物实验，体外研究即可获高预测性资料，在开发新药中降低成本和时间，缩短进入市场的时间等优点。三维细胞培养的缺点与局限三维细胞培养对药物研发和毒性测试意义重大，但当期也有一些问题尚待解决。总体上说，材料科学与生物学的结合使当前3D培养方式越来越多样化，用户的选择空间很大，可在比较中找到最适合自己的方法。众多的3D培养方法重点关注如何让3D体系更加接近人体实际环境，而对药物研发企业，他们除了模拟实际环境，还要求高效、自动化，使用成本大大降低。