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运用间期核荧光原位杂交对常见非整倍体的产前诊断

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2024-05-30 DNA 加入收藏

材料与仪器乙醇 HCl NaOH 甲酰胺甲醇冰乙酸柠檬酸钠 KCl 胰蛋白酶 SSCAneuVysion™ 试剂盒中提供的试剂步骤

材料与仪器

乙醇 HCl NaOH 甲酰胺甲醇冰乙酸柠檬酸钠 KCl 胰蛋白酶 SSC
AneuVysion™ 试剂盒中提供的试剂

步骤

3 . 1 用于FISH检测的未培养胎儿细胞制备 3.1.1 未培养羊水细胞的制备 1 . 解冻 4m L 胰蛋白酶/EDTA。 2 . 将 3〜5m L 清澈的羊水样品400g 离心 IOmin (见注释 11)。 3 . 弃上清。 4 . 用 4m L 胰蛋白酶/EDTA液重悬细胞。 5 . 轻柔振荡细胞悬液。 6. 37°C孵育 20min。 7. 400g•离心 IOmin0 8 . 弃上清。 9 . 慢慢滴入37°C预热的低渗液（0 . 8 % 柠檬酸钠或0.56% KC1 ) 重悬细胞，至终体积IOmU 10. 37°C孵育 20min。 11. 400g 离心 IOmin0 12. 弃上清。 13. 力口2m L 固定液（甲醇：冰乙酸= 3 : 1 ) 重悬细胞，轻轻混匀。 14. 将细胞悬液于2〜8°C放置至少I h 或至制片时。 15. 按细胞团块大小调整加入固定液体积： 400g 离心 IOmin, 弃上清，加 0. 8〜2m L 固定液（甲醇：冰乙酸= 3 : 1 ) 重悬细胞。 16. 用钻石笔在1 或 2 张玻片的背面标记2 个杂交区域（见注释 12)。 17. 在每一杂交区域滴约20^L 的细胞悬液（见注释 1 3 和 14)。 18. 滴好的玻片可直接变性杂交（见注释 1 5 ) 或放于有盖的玻片盒内一20°C 保存待用（见注释 16)。 3. 1 . 2 未培养绒毛细胞的制备 ■ 1 . 在显微镜下彻底清洗绒毛（见注释 17)。

2 . 将 1 或 2 片干净的绒毛转到一个35m m 的培养皿内用于FISH。 3 . 吸去多余的液体。 4 . 在绒毛上逐滴加2m L 固定液（甲醇：冰乙酸= 3 : 1)，固定绒毛。 5 . 室温孵育l 〇min。 6 . 更换 2m L 新鲜的固定液。 7 . 室温孵育lOmin。 8 . 移去固定液。 9 . 气干绒毛。 10. 加 0. 5〜0.8m L 解离液（6 0 % 乙酸）。 11. 室温孵育5min，可用细的玻璃滴管轻轻混合以促进细胞解离，解离液加入 2m in后可开始准备制片。 12. 用钻石笔在1 或 2 张玻片的背面标记2 个杂交区（见注释 12)。 13. 在每一标记杂交区滴约2(V L 的细胞悬液 (见注释 1 3 和 14)。 14. 滴好的玻片可直接变性杂交（见注释 1 5 ) 或放于有盖的玻片盒内一20°C 保存待用（见注释 16)。 3. 2 F I S H 分析步骤 3.2.1 —般准备（见注释18) 1 . 将用于杂交的湿盒置于37°C 预热。 2 . 准备 37°C水浴。 3 . 准备（73±1)°C水浴。 4 . 将玻片电热板预热至45〜50°C 。 3 . 2 . 2 标本预处理（见注释19) 1 . 准备 40m L 2 X SSC 加到染色缸内，在 37°C水浴锅内预热；将标本置于 37°C 2 XSSC 中 30min。 2 . 从染色缸内取出标本晾干。 3 . 准备三缸室温梯度乙醇（7 0 % 、 8 5 % 和 1 0 0 % ) 。 4 . 将标本放入7 0 % 乙醇中2min。 5 . 从 7 0 % 乙醇中取出，迅速移入8 5 % 乙醇中2min。 6 . 从 8 5 % 乙醇中取出，迅速移入 1 0 0 % 乙醇中2min。 7 . 从染色缸中取出标本，晾干。 3. 2. 3 标本DNA的变性（见注释20) 1 . 确认变性液p H 在 7. O〜8. O范围内。

•将变性液倒入染色缸内于（73±1)°C水浴中预热至少 45min，在用前确认缸内的温度（见注释 21)。 3 . 将准备好的标本（每次不超过3 张）置于（73±1)°C变性液中变性5min，勿晃动。 4 . 准备三缸室温梯度乙醇（7 0 % 、 8 5 % 和 1 0 0 % ) 。 5 . 用镊子将标本从变性液中取出后立即置于7 0 % 乙醇处理2min，晃动玻片去掉残留的甲酰胺。 6 . 从 7 0 % 乙醇中取出，迅速移入8 5 % 乙醇中2min。 7 . 从 8 5 % 乙醇中取出，迅速移入1 0 0 % 乙醇中2min。 8 . 用吸水纸从玻片边缘吸去残留的乙醇，擦干玻片背面。 9 . 在准备加探针前2m in将玻片置于45〜50°C恒温平台。 3. 2. 4 准备探针混合物 1 . 探针在室温条件下逐渐解冻。 2 . 振荡装探针的离心管。 3 . 用微型离心机稍离心（3〜5s)。 3. 2. 5 杂交 1. 加 lOpLCEP-18/X/Y 探针混合物到一个标记的杂交区域，立即盖上 22mm X22m m 盖片，让溶液在盖片下均匀铺展，避免产生气泡。 2 . 加 IOjuL LSI-13/21探针混合物于另一标记的杂交区域，如上所述方法盖上盖片。 3 . 用稀释的橡皮泥封片：用 5m L 注射器吸入橡皮泥，沿载玻片和盖玻片重叠边缘滴加，在盖片周围封片。 4 . 将玻片放入37°C预热的湿盒，盖紧盖子， 37°C杂交 6〜24h 。 3 . 2 . 6 杂交后洗脱（见注释 20) 1 . 将 0. 3 % NP-40/0. 4 XSSC洗脱液加入染色缸内。 2 . 将装有〇 .3%NP-40/0.4XSSC洗脱液的染色缸放于（73±1)°C水浴预热至少 30min。 3 . 准备 0 . 1 % NP-40/2XSSC洗脱液于另一染色缸内，室温备用。 4 . 从杂交湿盒内取出玻片。 5 . 去掉一张标本的橡皮泥和盖片。 6•立即放于（73±1)°C 的 0 . 3 % NP-40/0.4XSSC洗脱液内。 7 . 晃动玻片3s 。 8 . 重复步骤5〜7 洗脱下一张玻片。

9 . 重复步骤 5〜7 洗脱第三张玻片，一次洗脱不超过3 张玻片。 1 0 . 自最后一张玻片放入后计时洗脱2min。 11•将玻片逐张移入室温的〇 .l % NP-40/2X SSC洗脱液中，洗脱 5〜60s。 12. 暗处晾干玻片（放于抽屉内关上即可）。 13. 每一杂交区域加IOjLtL DAPI-II复染液，盖上盖片。 14. 玻片置于暗处保存待检（见注释 23)。 3 . 3 信号检测 3. 3 . 1 总体评估玻片 1 . 用 10X 、 25X 和 40X 物镜总体评估标本情况，转换不同滤光片评估不同颜色的信号（蓝色、橙色或绿色）。 2 . 背景应该是暗的，几乎没有颗粒样荧光或模糊的影像。 3 . 用 25X 物镜扫描玻片，选择信号检测的合适区域。所选区域内的细胞应稀疏分布，一个视野下可以看到斗个细胞，只有少数细胞重叠。避免细胞密集分布、许多细胞重叠或细胞成团的区域。 3. 3. 2 信号计数 1 . 选择一个滤光片，用 40X 物镜扫描所选区域，分析该区域的左上象限区域。自左向右扫描，并跳过细胞密集区域。 2 . 计数每个间期核内的一种特异探针信号的数量。探针信号应明亮、清晰、易于观察。信号呈明亮致密或线状弥散在卵形核内。有时信号分成明亮的、距离非常近的两团，这种分开的信号可以作为一个信号计数。 3 . 继续扫描至计数5 0 个核，对特异靶进行分析。 4 . 对 5 种探针分别重复步骤1〜3 , 在不同滤光片下扫描相应的杂交区域。 5 . 在特定记录文件中记录结果。 6 . 对每种探针拍样品照片（数字化或幻灯）。 7 . 在专门设计的报告纸上报告结果，每个靶探针计数 5 0 个间期核，记录 LSI-13、 LSI-2 1 和 CEP-18出现 1 个、 2 个、 3 个、 4 个和 4 个以上信号的细胞数量和百分比。有关性染色体的报告需具有X、 Y 、 XX、 XY、 XXY、 XYY、 XXX 及其他的核数量和百分比。 3 . 4 结果判断 1 . 对一个靶信号的计数少于5 0 个间期核，应进行增补实验或者判断为无

结果。 2 . 如果至少8 5 % 的细胞为整倍体，确诊为整倍体。 3 . 如果至少8 5 % 的细胞具有同样的非整倍体信号，确诊为非整倍体。 4 . 如果超过1 0 % 的细胞具有同样的非整倍体信号，应继续分析100〜200个细胞。根据绝大部分细胞中检测到的信号， FISH 进行最终确诊。怀疑为嵌合体的病例，应进行标准的细胞遗传学分析。 4 . 注释 1 . 我们的实验操作程序主要基于其他已经发表的文献，并结合我们自身十多年的经验建立的。变性、杂交和洗脱方法基于购买的AneuVysion™ 分析试剂盒，总体按照Vysis建议的方法进行实验。 2 . 在适合的临床条件下，快速 F IS H 分析未培养胎儿细胞对主要常见非整倍体进行产前诊断是非常有效的工具。然而，临床医生应经过培训、患者应仔细咨询了解用FISH 进行常规产前细胞遗传学分析的优势和局限性。应该强调实验不能发现结构染色体异常、嵌合体或 13、 18、 21、 X 和 Y 之外的染色体数量异常 6 这些局限性也应该在FISH 结果的最终报告中详细注明。 3 . 本实验要求好的实验室经验和强制性学习曲线。在该技术用作临床工具之前，建议在细胞遗传学实验室中进行实验至少50〜100个病例。实验过程中得到的 FISH 结果与作为内对照的标准细胞遗传学分析结果相比较。实验只用作学习目的，不报告给临床医生和患者。 4.. ProbeCheck™ 阳性对照和阴性对照标本包括在AneuVysion™ 试剂盒中。正常男性和嵌合体羊水细胞分别作为阴性对照和阳性对照。这些对照标本可用来进行质量控制和培训技术人员对间期细胞F IS H 的结果判断。 5 . 对成功的FISH 杂交结果观察失败可能是荧光显微镜故障或状态不理想，或错误的滤光片选择造成的。应进行常规的显微镜清洁，定期由技术代表进行检查。激发光源应该正确安装，它的使用时间应该记录，使用寿命大约为 200h 。物镜根据放大倍数决定使用或不使用镜油。使用的镜油应该无自发荧光、专门用于荧光显微镜。建议使用适合AneuVysion™ 试剂盒的多带通和单带通荧光显微镜滤光片。 Vysis公司备有适于各种显微镜的滤光片。用浅蓝绿色、绿色和橘黄色荧光标记CEP-18/X/Y 和 LSI-13/21探针杂交的染色体可以用Aqua、 Green 或 Orange的单通道滤光片观察，也可以用 DAPI/Green/Orange三通道滤光块阅片。 SpectrumAqua信号呈现浅绿蓝色， SpectrumOrange信号呈现粉橘黄色， SpectnimGreen信号呈现绿黄色。其他 DNA用 DAPI染成蓝色。 6 . 建议用校准的温度计测量溶液、水浴锅和培养箱的温度，因为这些温度对结果非常重要。

7 . 未拆包装的AneuVysion™ 试剂盒在一20°C干燥避光条件下保存。开封的试剂盒的不同组分按下述说明保存： DNA 探针混合物、 DAPI-I I 复染剂和对照标本在一20°C避光干燥保存； 20X SSC 盐和 NP-40室温保存。未开封试剂盒各组分的过期时间在各自的包装说明中注明，这些保存条件适用于开封和未开封的 '组成。 8 . 荧光素在曝光后淬灭。为减少荧光淬灭，所有含有荧光团的溶液应该在弱光下操作。包括已经杂交标本的所有后续操作步骤。所有避光的操作（孵育过程、洗脱等)应在柔和光线下进行，避免强光直接照射荧光素。 9 . 甲酰胺是一种众所周知的致畸剂，用于制备变性液和探针混合物。应避免皮肤和黏膜接触。 10. DAPI-I I 复染剂中含有D A PI和 1 ，4-苯二胺游离碱。根据阳性基因毒性效应， DAPI是可能的致突变剂，避免吸入、误食或皮肤接触。 1 ，4-苯二胺是一种已知的皮炎致敏剂和潜在的呼吸致敏剂，避免吸入、误食或与皮肤接触。 11. 只用清澈的黄颜色羊水进行FISH。血红色或褐色的羊水，或含许多红细胞的细胞团块可能影响结果，得到错误的判断。 12. 玻片应该清洁、冰冷。将玻片保存在冰箱中，滴片前用冰冷的固定液洗片。不干净的玻片导致髙背景和妨碍阅片。 13. 大多数细胞遗传实验室的技术员对滴片经验丰富，然而，对间期核 FISH 实验来说，滴片是确保优质结果的重要步骤。稀疏分布的细胞限制观察者选择状态最好的细胞核来计数信号，细胞过于稠密的杂交区域很难将细胞和信号相联系。正确的滴片保证结果观察的方便和直观。在滴片前根据细胞团块的大小调节悬液体积，从尝试和错误中吸取经验，滴出高质量的标本。 14. 因为 AneuVysion™ 试剂盒由两套探针构成： LSI-13/21和 CEP-18/X/ Y ，每个病例最少要求两个杂交区域。一张玻片上制备2 个杂交区域对技术要求不是太高，但一张片子上找一个杂交区域比较简单。每张试验片最好制备一个备份，备份标本不进行杂交，放在有盖的盒子中一20°C保存。 15. 标本质量是影响杂交程度的重要因素。建议在变性和杂交前，在相差显微镜下检查标本的质量。评估玻片上的细胞密度和间期核周围细胞质的存在与否。 16. 在标本制备和操作的某些阶段可长期保存样本。未滴片的在固定液中的羊水细胞或绒毛细胞悬液可以在一 20°C冷冻保存。制备好的标本在杂交前也可以保存在有盖的盒子中，放入塑料袋封口后，一 20°C保存。 17. 只选择干净的绒毛进行分析。因蜕膜或母血污染的样本可能影响结果，导致错误的判断。蜕膜外观通常为白色球状组织，没有发芽或血管，它们通常具有海绵样或 “糊状”外观。好的绒毛具有发芽的白色分支，至少一些分支上有血管。

18. HYBrite™ 变性/杂交系统是Vysis生产的一种按键操作仪器，它可以同时对 1 2 张玻片进行变性和杂交。减少对变性试剂、水浴锅和孵育设备的需求，节省大约45miti操作时间。用 HYBrite™ 进行操作更简便、更安全。我们认为实验操作程序更准确，对困难样本也能得到更好的结果。 19. 标本预处理是选择性的。只有妊娠后期（超过 1 8 周）的羊水才需要预处理。我们采用如上所述的方法处理所有样品，再进行间期核FISH 分析。 20. 在每个染色缸中一次不能变性或洗脱3 张以上的标本。 21. 严格控制温度和缓冲液浓度对变性非常重要。变性液温度必须为（73士 1)°C ，每次使用前进行确认。变性液的p H 在每次使用前也必须调至7.0〜8.0。 22. 对最后一次乙醇洗脱、将玻片转移到玻片电热板上以及加土探针混合物等步骤严格计时，这对杂交成功非常重要。如果在探针准备好之前，玻片需要等待超过 2min，应该将玻片放在1 0 0 % 乙醇中等待杂交。 23. 杂交标本盖上盖玻片后在一20BC避光保存。在这样的保存条件下，杂交标本可以保存一年以上而荧光信号强度基本没有损失。

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