荧光抗体的制备

1   荧光素与抗体结合（标记）   2   荧光抗体的纯化   3   荧光抗体的鉴定    1.荧光素与抗体结合方法：     ⑴ 透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体                     积小的抗体溶液的标记                 ②标记较均匀，非特异荧光较低        ⑵ 搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品                     体积较大的抗体溶液的标记                 ②标记时间短、效率较高，荧光                     素用量节省                 ③影响因素多，非特异荧光较强 **透析法 第一步：   将含10mg/ml的Ig溶液10ml               装入透析袋。 第二步：   将上述透析袋放入烧杯中 ：               含0.1mg/ml FITC的               pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。 第三步：   4℃磁力搅拌24h。 第四步：   取出透析袋，进行纯化、鉴定 **搅拌法 第一步：   将含40mg/ml BP 溶液5ml               装入反应瓶中。 第二步：   加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐               缓冲液4ml                  第三步：   25℃磁力搅拌下，逐滴加入               1ml含2mg的FITC溶液 第四步：   25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌             4h，然后进行纯化、鉴定 2. 荧光抗体的纯化：   ⑴ 除去未结合荧光素   ⑵ 除去标记不适当的抗体   ⑶ 除去非特异反应物质   *****     (1)除去未结合荧光素：      A 透析法：   将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲 液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。   B 凝胶过滤法：   葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml.        (2)除去标记不适当的抗体：       采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。       未结合荧光素的抗体，所�负电少，最先洗出。       过量结合荧光素的抗体，所�负电多，最后洗出。     (3)除去非特异反应物质：     将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。     按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。         3. 荧光抗体的鉴定：     ⑴ 抗体含量测定：双扩法     ⑵ 结合比率(F/P)测定：       分光光度法，并按下式计算：       FITC:   F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495)       RB和TRITC:     F/P= A515 / A280       *   F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。     *   固定标本染色以F/P=1.5左右为宜     *   活细胞染色以F/P=2.4左右为宜