PCR产物的检测点杂交

  1．寡核苷酸探针杂交        [试剂与配置]       预杂交液：5×SSC，5×Denhadrt, 0.5%Triton X-100        2×SSC/0.1%SDS       1×SSC/0.1%SDS       0.1×SSC/0.1%SDS        [操作方法]       (1) 将2×SSC湿润的杂交膜放入50ml试管中，再加入5～10ml预杂交液，盖上盖子；       (2)置于杂交炉中，在杂交温度下(比探针Tm值低5～10℃)预杂交10min；       (3)加入适量标记探针，终浓度为1pmol，在杂交温度下，旋转20min；       (4)倾出杂交液，加入30ml 2×SSC/0.1%SDS于杂交温度下漂洗2次，每次5min；       (5)倾出溶液，加入1×SSC/0.1%SDS于37℃漂洗2次，每次5min；       (6)0.1×SSC/0.1%SDS洗2次，每次5min，即可直接用于显色。         2．反向点杂交       [操作方法]       (1)将固定探针的尼龙膜放入50ml试管中，加入适量杂交液，在杂交温度(地高辛68℃，生物素55℃)下预杂交2hr；       (2)将1/10体积标记的PCR产物煮沸5min (或加入等体积的400mmol NaOH,10mmol EDTA 变性5min)，冰浴5min；       (3)加入变性的PCR产物，混匀，杂交温度下温育30～120min，漂洗同前。