Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > 免疫技术

免疫技术

戊二醛二步法制备HRP结合物

2025-05-29 免疫技术 加入收藏
1.  原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶 - 戊二醛 - 免疫球蛋白结合物。    2.  标记步骤:

 1.  原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶 - 戊二醛 - 免疫球蛋白结合物。    2.  标记步骤:    (1)  称取 HRP25mg 溶于 1.25 %戊二醛溶液中,于室温静置过夜。    (2)  反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在 1ml / 1 分钟,收集棕色流出液。如体积大于 5ml ,则以 PEG 浓缩至 5ml 。放置 25ml 小烧杯中,缓慢搅拌。    (3)  将待标记的抗体 12.5mg 用生理盐水稀释至 5ml ,搅拌下逐滴加入酶溶液中。    (4)  用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25ml ,继续搅拌 3? 小时。    (5)  加 0.2M 赖氨酸 0.25ml ,混匀后,置室温 2 小时。    (6)  在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置 4 ℃ 1 小时。    (7)   3000rpm 离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4 的 PBS 中。    (8)  将上述溶液装入透析袋中,对 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析,去除铵离子后 ( 用萘氏试剂检测 ) , 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。    3.  结果判定:    (1)  定性及效价滴定:用特异性抗原 ( 或抗体 ) 同酶标记抗体 ( 或抗免疫球蛋白抗体 ) 作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。最后以直接 ELISA 法 ( 或在正式实验系统里 ) 对酶结合物进行滴定 ( 见本节 ( 三 ) 工作浓度的选择 ) 。    (2)  定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定 ( 光程 1cm) 。   酶量 (mg / ml) = OD403nm × 0.4    IgG 量 (mg / ml) = OD280nm-OD403nm × 0.42) × 0.94 × 0.62          酶量 (mg / ml)    IgG 量 (mg / ml)   酶量   克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4            40,000        160,000     IgG 量     (3)  本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有 2 ~ 4 %的酶与蛋白质结合。

 

   4.  试剂及器材:    (1)   0.1M PH6.8 磷酸缓冲盐水 (PBS) :取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml , NaCl1.8 克,加蒸馏水至 200ml 。    (2)   1.25 %戊二醛液:取 25 %戊二醛 50ml 与 PH6.8 的 PBS1ml 混合。    (3)   1M PH9.5 碳酸盐缓冲液:取 1M 碳酸钠 3ml 与 1M 碳酸氢钠 7ml 混合。    (4)   0.2M 赖氨酸溶液:称赖氨酸 29.2mg 溶于 0.01M PH9.5 碳酸缓冲液 1ml 中。    (5)   0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。    (6)   PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。    (7)  萘氏试剂及聚乙二醇 (PEG , MW2000) 。    (8)  纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。    (9)   HRP(RZ>3.0) 。    (10) Sephadex G-25 层析柱 (2cm × 50cm) 。    (11) 搅拌器,分光光度计,离心机。    (12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。


文章底部广告位

文章评论

加载中~