IL-2质粒DNA探针制备的操作步骤
IL-2 质粒DNA探针制备的操作步骤 (1)含IL-2质粒DNA探针的提取 取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基(含100μg/ml Amp) ↓37℃ 220r/min 振摇过液(约16h ) 取10ml菌液加200ml LB培养液(含100μg/ml Amp) ↓37℃ 150r/min振摇 4h 加氯霉素(终浓度170μg/ml) ↓37℃ 220r/min振摇3h 菌液倒入300ml离心管中离心 ↓4℃ 5000r/min×10min离心弃上清除去残液(吸水纸无菌) 每管加40ml STE溶液(冰预冷)悬浮细菌后,用移液管转入到50ml离心管中 ↓4℃ 5000r×15min离心 弃上清,加5ml溶液1(冰预冷)悬浮细菌,加1 ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10g/ml) ↓轻摇,室温静置5min 加10ml溶液II,盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混合液体,不要用旋涡振荡器 ↓冰浴10min,且勿摇动 加7.5ml溶液III(冰预冷)摇振荡离心管数次使之混合 ↓冰浴20-30min,使沉淀完全,4℃ 12000r/min×20min离心 取上清到另一50ml离心管中,加0.6体积异丙醇,混匀、室温静置15min ↓室温5000r/min×15min离心弃上清 用75%乙醇洗涤沉淀一次(不将沉淀悬浮),将乙醇倒置吸水纸上,使乙醇挥发 ↓ 用1.5m1TE(pH8.0)将沉淀溶解加等体积冰预冷的5MLiCl,混匀后置冰溶10min ↓4℃12000r/min×10min离心 取上清至新EP管,加等体积的异丙醇(约3ml)充分混合、室温静置15min ↓室温12000rmin×10min离心(回收沉淀的核酸) 小心去上清,将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用75%乙醇洗涤沉淀,流尽乙醇,用吸低吸去附于管壁的液滴,将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发 ↓加入RNA酶(终浓度100μg/ml)用500u1TE溶解沉淀DNA,移至新EP管中 ↓37℃水浴30min 加等体积(500ul)含13%(W/V)PEG(800)的1.6mol/L NaCl,充分混合 ↓4℃ 12000r/min×5min离心 吸去上清用400u1TE(PH8.0)溶解质粒DNA沉淀 ↓ 加等体积饱和酚(400ul)混合 ↓12000r/min×10min离心 吸上层水相移至另一EP管加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)剧烈混匀至乳白状 ↓12000r/min×10min离心 吸上层水相移至另一EP管,加等体积氯仿:异戊醇(24:1)混匀 ↓12000r/min×10min离心 吸上层水相移至新EP管(硅化)、加入0.1体积的3mol/L NaAC(pH5.2)和2体积的-20℃,预冷的无水乙醇、混匀(可见沉淀出现),置-20℃2h或0℃20min ↓4℃12000r/min×15min离心 弃上清,加75%乙醇(4℃预冷)200u1,稍加振荡,离心洗涤2次 ↓4℃12000r/min×5min离心去上清. 敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量与乙醇挥发. ↓ 溶沉淀于11μlTE溶液中 ↓ ↓ 取1μl电泳 其余进行酶切 (2) 经0.7%琼脂凝胶电泳,确定有质粒DNA后,用XhoI进行酶切. 酶切反应体系:10μl质粒DNA,6μl内切酶XhoI,6μl 10 X酶切缓冲液,38μl蒸馏水,总体积为60μl;37℃消化过液。 (3) IL-2 DNA片段的回收和纯化 可以使用任何一种回收与纯化DNA片段的方法,下面介绍的是用WizardTN PCR纯化试剂盒回收IL-2 DNA片段。 1)将60μl酶切反应体系经1%琼脂糖凝胶电泳; 2)紫外灯下切下IL-2 DNA片段,挑出凝胶到EP管中,加1 ml Resin,使凝胶深化; 3)用5ml一次性注射器将Resin/DNAmix转移到Wizard Minicolumn中, 4)用2ml80%异丙醇洗涤Minicolum; 5)12000g离心20min; 6)将Minicolumn转移至新EP管中,加50ul3三蒸水到Minicolumn中,12000g离心20S,收集DNA。