红细胞花环法检测各类免疫细胞的数量

红细胞花环法检测各类免疫细胞的数量   【基本原理】     采用戊二醛交联技术将McAb或兔抗鼠IgG与羊红细胞（SRBC）结合，制成致敏的SRBC。抗体致敏的SRBC可与T淋巴细胞直接或间接结合，在T淋巴细胞周围形成花环。通过计数花环形成率，从而确定T淋巴细胞各亚群。该方法可分为直接红细胞花环法和间接红细胞花环法。现以间接花环法为例。 【试剂及材料】 （1）         醛化二抗致敏的SRBC （2）         May-Gruenwald和Giemsa染液。   【操作方法】 （1）         根据待测样品数，取一定量的致敏红细胞悬液，离心去上清，用含20％新生小牛血清（NCS）的RPMI-1640液悬浮，恢复至原体积，4 ℃备用； （2）         用含20％NCS的RPMI-1640液将PBMC配成5×104 /ml。将试管呈20度角斜放，于37 ℃温育45min，吸出非粘附细胞置另一试管中备用。原试管弃去，以免混入粘附细胞； （3）         将上述淋巴细胞悬液分别加入塑料软板中，每孔25μl，每份标本加4孔，再分别加入抗CD3 、CD4、CD8的McAb 25μl，同时设阴性对照，置4 ℃作用30min； （4）         取出，用RPMI-1640液洗涤3次，每次1000r/min离心1min，最后弃去上清，每孔加入上述致敏红细胞悬液25μl，混匀，室温下作用10min，500r/min离心10min，继续在室温下作用1 h，然后放4 ℃作用1 h或过夜； （5）         取出，轻轻悬浮，用May-Gruenwald和Giemsa染液染色。   【结果观察】     高倍镜检查.淋巴细胞周围粘附有3个以上SRBC者即为花环阳性细胞。共计数200个淋巴细胞，计算出花环形成细胞百分率，以确定T细胞各亚群的百分率。