免疫组化非特异性背景染色及其控制方法
一、非特异性染色的识别 常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处,坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性,均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。 二、非特异性染色的原因 1. Ig与Fc受体结合 多见于冰冻切片(特别是淋巴造血组织,淋巴细胞,单核细胞,组织细胞表面多),主要是和二抗反应,因为一抗一般稀释度均较大,因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体,所以石蜡切片不多见。 避免方法: ① 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片; ② 用不含Fc段的抗体,但价格贵 (V区,C1区不含Fc段,用Pepsin消化) 2.静电吸附 抗体是一种带负电荷的球蛋白,容易和带正电荷的组织相结合,如胶原纤维。 避免方法: ① 尽量稀释一抗 ② 降低抗体的电荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS; ③ 用去垢剂 如triton-100处理切片。 Tween-20等; 3.二抗与组织中的Ig结合 如羊抗兔的二抗,二抗可以标本中(人)Ig发生交叉反应,科学上越接近的动物,交叉反应越 明显,如人与猴,兔与豚鼠。 避免方法:用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。 4.组织中残存醛基与Ig的结合 如醛类固定后未能彻底的冲洗,残流醛基可以和Ig结合。 避免方法: ①彻底冲洗; ② 0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗; 5.内源性过氧化物酶 红细胞,粒细胞的含量尤其高,镜下可以识别,不要将其当成阳性结果。 避免方法: ① 石蜡切片 0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片; ② 冰冻切片 3%双氧水处理切片5分钟(99:1)因为未经固定包埋,大部分酶未被破坏; ③ 对于骨髓涂片 最好用非过氧化物酶标记的抗体 如碱性磷酸酶(AP) ↓ 磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料 ↓ 快兰(fast blue)或快红(fast red) ↓ ↓ 兰色 红色 用明胶甘油封片,不能用含二甲苯的封片剂,溶于二甲苯。 6. 内源性生物素 以 24mg/ml的卵白素封片15分钟; 7. 交叉反应 PcAb敏感性高,但特异性稍低,容易出现非特异性染色。 避免方法: ①尽可能稀释抗体; ②尽可能用McAb; 三、 抗体最大稀释度的求法 最大稀释度的目的: 1.节约、 2.特异性染色↑、非特异性染色↓(决定其最大稀释度) 棋盘法 如 稀释度 1:50 1;100 1:150 1;200 特异性染色 +++ ++ ++ + 非特异性染色 ++ + - -