反向空斑形成试验（RHPA）

一、基本原理

反向空斑形成试验（reversed hemolytic plaque assay，RHPA）是一种体外检测人类Ig分泌细胞的方法。该法将待检人的PBMC或组织来源的淋巴细胞（如扁桃体、脾细胞等）、SPA致敏的羊红细胞（SPA-SRBC）、抗人Ig抗体及补体4种成分混合，注入由两张玻片制成的小室内，密封小室，37℃温育3～5h。

此时抗人IgG抗体的Fc段与SPA-SRBC结合，抗体形成细胞分泌的IgG与抗人IgG结合后，活化补体，介导SPA-SRBC的溶解。在分泌Ig的细胞周围形成园形的溶血区，称为溶血空斑。每一个溶血空斑即代表一个Ig分泌细胞。

二、试剂及材料

1. 1:2 SRBC/阿氏液

2. SPA

3. 豚鼠补体

4. 多克隆兔抗人Ig（56℃，30min灭活）

5. 多克隆诱导剂

三、操作方法

1. 抗体分泌细胞的诱导：

①将分离的PBMC或B细胞用含5％NCS的RPMI-1640培养液洗涤3次，每次1000r/min离心10min，以除去外源Ig；

②用含10％NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105 /ml，接种24孔细胞培养板，1ml/孔；

③每孔加入适当稀释的多克隆刺激剂20μl（如PWM溶液终浓度为1:100），并设未加刺激剂的空白对照孔；

④将培养板置37℃，5％CO2 温箱培养10d后待测。

2. SPA致敏SRBC：

①SRBC/阿氏液（1:2）悬液用生理盐水洗涤3次，每次1200r/min离心10min；

②将沉淀细胞1800r/min离心10min，弃上层淡黄色液体，沉淀SRBC备用；

③将SPA 5mg溶于5ml生理盐水中；

④将CrCl3 溶于5ml生理盐水中（配制后必须在10min内使用；

⑤分别取10.4ml生理盐水、0.1ml CrCl3、0.5ml SPA和1.0ml SRBC，加至离心管内，加盖，混匀，37℃温育1h，其间振摇3～4次；

⑥将致敏SRBC用生理盐水洗涤3次，每次1200r/min离心10min，加入平衡盐溶液，4℃保存备用（不超过一周）。

3. 补体的处理：

①取抗凝羊血15ml用冷PBS洗涤3次，每次1200r/min离心10min（4℃），弃上清；

②将SRBC用4倍体积的冷PBS洗涤一次，4℃下1800r/min离心10min；

③将SRBC与豚鼠补体按1:4（V/V）混合，4℃作用2h后，4℃下1800r/min离心10min，收集上清即SRBC吸收为处理过的补体，分装后，置-20℃保存备用。

4. 抗血清的处理：

将鼠抗人Ig与冷PBS洗涤沉淀的SRBC按1:2（V/V）混合，置4℃作用2h后，4℃下1800r/min离心10min，收集上清分装，-20℃保存备用。

5. 空斑形成及计数：

①抗体分泌细胞的制备:将诱导培养的细胞或新鲜分离的PBMC或淋巴细胞用RPMI-1640洗涤3次，每次1200r/min离心10min，弃上清后，沉淀细胞用洗液调至所需浓度；

②空斑混合液的配制:将致敏的SPA-SRBC、补体和抗Ig抗体按等体积混合均匀；

③分别取75μl空斑混合液和125μl细胞悬液加入微量平底板孔中，用毛细吸管充分混匀，注意不要形成气泡；

④用微量进样器将混悬细胞转至已准备好的两张玻片制备的小室中，每室约50μl，每份样品设复孔；

⑤用毛细吸管加入温热的石蜡-凡士林混合液封闭小室；

⑥将密封后的小室置37℃温育3～5h后，在显微镜下（10×）或半自动空斑计数器上计数空斑形成细胞。

四、注意事项

1. 不同的抗体检测方法，要求的培养时间不同。ELISA法一般培养7d左右，而反向溶血空斑法和ELISPOT则需培养10d。

2. ELISA是检测诱导细胞培养上清中的抗体，而反向溶血空斑法和ELISPOT是检测分泌抗体的细胞。