免疫组化双染实验流程

一、脱蜡和水化

方法同SP法。

二、第一抗体的染色

1、将切片浸在3%H2 O2 甲醇溶液（新鲜配制）中10 min，PBS冲洗3 min×3次；

2、加100 ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10 min，倒掉（不能冲洗）；

3、加入一抗（按照说明书推荐浓度和孵育条件）；

4、使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)，冲洗5 min×3次；

5、加入100 ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10 min；

6、用TPBS冲洗5 min×3次；

7、加入100 ul（2滴）链霉亲和素-AP（试剂3）的二抗，室温孵育10 min；

8、用TPBS冲洗5 min×3次；

9、准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1 ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂4C，充分混匀；

10、加100 ul（2滴）配好的AP底物溶液，室温孵育（镜下掌握孵育时间）；

11、使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应。

三、第二抗体的染色

12、加100 ul（2滴）双染增强剂（试剂7），孵育；

13、用TPBS冲洗3 min×3次；

14、加100 ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10 min，倒掉（不能冲洗）；

15、加入稀释好的一抗（按照说明推荐浓度和孵育条件）；

16、用TPBS冲洗5 min×3次；

17、加入100 ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10 min；

18、用TPBS冲洗5 min×3次；

19、加入100 ul（2滴）链霉亲和素-HRP（试剂5）的二抗，室温孵育10 min；

20、用TPBS冲洗5 min×3次；

21、 准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1 ml去离子水中，充分混匀。再加入1滴试剂6C，充分混匀；

22、 加100 ul（2滴）配好的HRP底物溶液，室温孵育（镜下掌握孵育时间）；

23、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应；

24、 使用复染试剂染色（根据需要选择）；

25、 封片剂（试剂8）封片，显微镜观察并拍照。