杂交瘤的克隆化：有限稀释法

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。

要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。

即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

有限稀释法克隆步骤为：

（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。

（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。

（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。

（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

（6）8～9天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

（8）每个克隆应尽快冻存。