分泌型ScFv的产生

分泌型ScFv的产生    【材料和试剂】   （1）SB培养基   （2）20mol/L MgCl2溶液   （3）50mg/ml 氨苄青霉素溶液    【操作步骤】    (1)将用ELISA检测有活性的克隆扩大培养,制备质粒DNA。    (2)转化E.coli DH5α或 JM83(注意:必须是非supE菌株才能表达分泌型抗体);    (3)挑选单克隆接种于10ml SB中,其中还含有20mmol/L MgCl2和50μg/ml Amp,37℃培养6h。加入终浓度为1mmol/L IPTG,30℃培养过夜。    (4)4000r/min离心15min收集菌体。在上清和菌体中均含有ScFv,通常菌体中的浓度高于上清。    (5)将菌体重悬于1ml PBS,在液氮中冻结5min后,于37℃水浴融化。重复冻融3次。    (6)于15,000r/min离心去除菌体碎片。将上清转移后,可用竞争抑制法测定其活性。如果在ScFv末端加上一段有抗体识别的短肽,则可直接测活。