免疫组织化学技术疑难问题剖析

免疫组织化学技术疑难问题剖析 1．非特异性背景染色非特异性背景染色的常见问题和解决办法常见问题                                 解决办法操作过程中漂洗不充分           每步步骤后冲洗3次，每次5分钟加试剂后切片干燥               防止切片干燥组织切片折叠                   勿取折叠处观察染色结果组织中所含过氧化物酶未阻断     可再配制新鲜3％H20：封闭，孵育时间延长组织中所含内源性生物素未封闭   使用阻断剂阻断内源性生物素组织抗原弥散                   组织及时固定，固定液要符合标准切片黏附剂过厚                 重新配制黏附剂涂片血清蛋白封闭不充分             延长血清蛋白封闭时间或再次用2％BSA封闭 2．染色过强。染色过强的常见问题和解决办法    常见问题                                    解决办法一抗浓度过高或抗体孵育时间过长          降低一抗浓度或缩短一抗孵育时间孵育温度过高，超过37℃                  一般室温20～28℃生物素化二抗或SABC-POD孵育时间过长      缩短孵育时间DAB显色时间过长或DAB浓度过高            显色时间不能超过5―10分钟，以显微镜下观察为准  3．染色弱。染色弱的常见问题和怒决办法     常见问题                                                  解决办法抗体浓度过低或孵育时间过短                         提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟试剂超过有效使用期                                 及时更换试剂操作中。滴加试剂时缓冲液未沥干。致使试剂稀释       每步骤滴加试剂前吸干切片中多余的缓冲液复染或衬染太深                                     复染时要淡染细胞核室温太低，低于15℃                                 适当延长孵育时间组织经固定和包埋等处理后组织抗原被破坏，           新鲜组织及时固定。防止自溶残留抗原未被抗体检出蛋白过度封闭                                       封闭时间不要超过10分钟 4．染色阴性。染色阴性的常见问题和解决办法    常见问题                                   解决办法操作步骤错误                              重新实验，设立阳性对照组织中无抗原                              设立阳性对照实验，以验证实验结果一抗与二抗种属关系错误                    仔细检查一抗与二抗种属关系试剂盒与显色系统不相匹配                  使用与试剂盒相匹配的显色系统试剂盒中一种或多种试剂活性降低            不同批号试剂盒不能混用，不能使用过期试剂盒