重组大肠杆菌的发酵罐培养

材料、设备及试剂

一、材料

种子培养液

二、设备

1. 7L发酵罐

2. 5ml离心管

3. 分光光度计

三、试剂

100mmol/L IPTG贮存液

1mg/mL卡那霉素（Km）贮存液

操作步骤

1．接上pH电极的插头, 接通底部冷却水管和空气出口处的冷凝器上的冷却水管, 将各硅酮管置于相应的蠕动泵上。

2．把搅拌马达置于搅抖联动装置上。

3．把光标调到“Temperature”档, 设定温度为30℃。

4．校正DO电极的满刻度。

1)利用光标将搅拌速度调至最大转速，一般为800r/min,把通气量调节到1.0L Air/L edium/min(1VVM)。

2)调到calibration界面，光标调至DO处，“span”档,设定读数为100，反复调节几次，直至稳定至100，转至menu界面。

5．其他参数设定。

1) 把光标调到Agit档，设定最小值为200r/min。把光标调到DO档,设定参数为10/20/30, 调整为与溶氧偶联检测。把光标调到Agit档，设定最大值为800r/min。

2)把光标调到pH档,设定参数为7.0，调整为自动检测。

3）接上酸（碱）瓶，并打开自动检测系统。

6．接种。

1)将蘸满乙醇的棉花球缠在接种口外套上, 点燃火焰以前将接种口的盖子旋松。

2)点燃棉花球, 取掉盖子, 立即在火焰中补加1mg/mL卡那霉素（Km）贮存液到发酵罐中，使终浓度100μg/mL，以及各组分培养基, 记录pH显示值，取样，测量实际值， pH Setpoint 为显示值，接种。

3)将盖子浸泡在乙醇中, 接种后, 用摄子将盖子准确放回原位, 旋紧。

7．打开记录实验过程的专用软件。

8．培养至OD600>10.00(6-8hrs左右)，加入IPTG至终浓度为1mM，继续发酵培养，葡萄糖浓度降至5g/L时补加葡萄糖。必要时可随时镜检细菌生长状态及是否受到污染。

9．发酵至pH值上升到7.3时(24hrs)发酵结束。

10．菌体收集：发酵完毕后，4℃ 8000r/min离心10min，收集菌体，－20℃保存备用。

11．发酵过程中，每隔两小时记录溶氧、转速（记录平均值）、测定OD600，取样品5ml放入事先称好重量的离心管(各3个）内，补料前后要取样。