细菌学诊断新技术(二)

与PCR相比它不用热循环，因此不必调节反应温度，所有反应在一个反应管中完成。另外3SR能区分DNA和RNA,同其它扩增反应一样，3SR易受外源核酸的污染。由于反应所需的酶多，并且与其它方法相比，反应严格性低，所以特异性较差。

1989年Cangene发明了核酸片段扩增法（NASBMTM），此法已获得欧洲专利。据报导它能将100个分子的DNA扩增到100ug.

1.1 放大信号检测法

放大信号同时能改善DNA探针的敏感性。有些学者研究处用腺嘌呤酯标志DNA的生物化学检测方法，反应初始时需加入H2O2,酯结构的破坏会产生光，光亮强度与存在的靶DNA含量成比例关系，也有人用一种称作磷酸苯二氧化物做生物发光剂，有报导称，此物质在碱性磷酸酶作用下转化为发光物质，用比色法检测它比OPD和HRP敏感10倍以上。

1989年Mclaprae介绍了用化学显影学致敏剂作为标记物，加热后，能释放出光，用固相薄膜检测能增加敏感性，生物化学发光法在DNA探针检测上效果很好。

最近推崇非同位素的标记物是酶标抗体。标记抗体能与共价结合的DNA探针标记物相结合。

如在探针尿嘧啶残基上标记荧光素，再用高度亲和力的辣根过氧化物酶标记抗荧光素抗体检测原始探针。胞嘧啶磺化物或在鸟嘌呤上引入2-乙酰氨基荧光素及其衍生物也能替代荧光素和酶连结抗体。

另一种途径是把非活性的S-肽从核糖核酸酶上连结到DNA探针上，杂交后，加入S-蛋白，可重新构建功能酶。再循环酶放大系统中检测活化的核糖核酸酶。

现又研究出一种新方法，它是把探针切成两半，每半标记两种不同的能相互联结的荧光物质或酶系统成分中的一种。当两种探针杂交相互靠近时，激活能量状态的荧光物质转移到邻近的荧光物质或酶系统受体上，而激活受体产生信号。反应过程不用进行分离，因为若没有发生杂交反应，两种成分不能相互靠近，不会产生检测信号。

2. 分子生物学技术在食源性病原菌检测上的应用：

2.1 沙门氏菌

食品中沙门氏菌污染量小，常受应激损伤，不易恢复，现用检测方法得到阴性报告最少需四天，阳性报告还要延迟2-3天。研究检测沙门氏菌的探针难度大，因为它拥有2000多个血清型，还不清楚它们是否存在共同特异性的致病因子。

Fillal等人从染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针，能识别350株不同的沙门氏菌。由于该方法最小检出量只有1个细菌/25克样品，所以需要增菌培养。

AOAC最近认可了Gene-Tark沙门氏菌比色分析法。这种探针标记物为异硫氰酸荧光素（FITC），再用辣根过氧化酶标记抗FITC的抗体结合放大探针，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上杂交，对239株沙门氏菌的特异性检出率为100%,假阳性率为0.8%（BAM/AOAC培养法假阳性率是2.2%.）

2.2 李斯特杆菌

1981年首次确定它是一种食源性病原菌，1985年加尼福利亚发生爆发性流行，现用检测方法大多采用冷增菌，费时费力。

FDA于1987年最新研制出针对李斯特菌致病基因β�溶血素的探针，随后GENE-TARK研制出商品化检测李斯特菌的DNA探针，它能特异性识别细菌的16SrRNA.该探针是由人工合成的寡核苷酸，用比色法检测样品需先在LEB中培养16�22h,然后侵染比色检测，假阴性率为0.8�4.7%（常规法为1.4�2.9%.）

1989年Bessesea等运用扩增李斯特菌溶血素基因中386bp的PCR方法检测单核细胞增生型李斯特菌，DNA检测量低于25ng,即少于1000个菌体，特异性强，能检测出50株不同的单核李斯特菌，而不与12株非单核李斯特菌和12种非李斯特菌属的细菌发生反应。

2.3 弧菌

关于用DNA探针检测溶血性弧菌中溶血基因的报导很多。

国外对DNA探针和单克隆抗体法在检测鞭毛抗原方面作了比较，结果发现DNA探针法阳性检出率高。近年来用PCR扩增DNA片段，再做探针检测，能检出新鲜龙虾仁中的弧菌，检测敏感性为10个细菌/克，但要用凝胶电泳进一步鉴定。因此，不太合适检测食品。1989年Olive构建了一个热稳定溶血素基因的寡核苷酸DNA探针检测付溶血弧菌。

2.4 志贺氏菌

目前志贺氏菌检测方法存在着质粒容易丢失和受内源菌干扰的问题。用核酸探针检测可克服上述缺陷。现采用人工合成32P标记的寡核苷酸探针在固定薄膜上做菌落杂交检测志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌（EIEC），也有人用PCR扩增技术检测志贺氏菌和（EIEC）。

PCR扩增前需将福氏痢疾菌扩增培养到10000个/ml,增菌后检测需6�7小时才能得到结果。敏感性为≤1个细菌/克。但PCR扩增后需做凝胶电泳进一步鉴定，对常规检测来讲太繁琐。