出血热病毒分离、鉴定和诊断方法

出血热病毒分离、鉴定和诊断方法包括病毒分离、电子显微镜、检测抗原、检测病毒特异性抗体和核酸检测。其中分离到病毒是诊断各种出血热的“最高境界”，尤其是对那些未知的传染病。绝大部分出血热患者在入院时处于病毒血症期，有利于病毒分离。

器材：

电子显微镜等。

试剂：

① ELISA试剂盒

出血热病毒分离、鉴定和诊断的基本过程可分为如下几步：

（一）病毒分离

A 细胞培养

① 绝大部分出血热患者在入院时处于病毒血症期，有利于病毒分离。患者的样品（血清或研碎组织）应该做系列稀释，然后接种细胞。

② 接种后的细胞要每天观察病变，定期用 IFA 和 ELISA 检测病毒抗原，用 RT-PCR 检测病毒 RNA。

③ 感染 1 周后，如果细胞培养病毒阴性，把细胞培养液上清盲传 1~2 代，每代用免疫荧光法或 RT-PCR 检测病毒。

B 动物接种

在没有细培养条件时，可以用患者血液或组织接种动物。各种病毒的宿主不同，实验动物也有区别。

① 汉坦病毒具有多宿主性，每一个血清型的汉坦病毒都有各自的宿主动物，哺乳动物、鸟类、爬行动物和两栖动物大约 200 种动物可以感染汉坦病毒，但具有流行病学意义的宿主动物和传染源主要是啮齿动物。易感动物有多种，如黑线姬鼠、长爪沙鼠、小白鼠、大白鼠等，但除了小白鼠、乳鼠感染后可发病及致死外，其余均无明显症状，实验室中常人工感染小白鼠，特别是对其乳鼠进行脑内接种汉坦病毒，增加病毒的毒力。鼠类是辛诺柏病毒的宿主，不同鼠种携带病毒的血清型 / 基因型不同，包括鹿鼠、棉鼠、白足鼠和其他鼠种。

新疆出血热病毒用于初代病毒分离的动物以出生后 24~48 小时内乳鼠最佳，每份标本接种 1 窝小鼠。敏感的鼠种包括瑞士种或昆明种的小白鼠。初代分离以脑内和腹腔接种为好，接种后观察 2~3 周。初代分离时，有时症状不典型或没有症状，需要传 2~3 代后才能有典型发病。病毒鉴定可用 ELISA、免疫荧光法、RT-PCR 和序列分析。

② 丝状病毒的最佳动物模型是猕猴，其在吸入或注射病毒后出现的感染症状与人十分接近。在猴子模型中，丝状病毒的毒力有相当大的可变性，这与人类对病毒感染的差异性相似。在埃博拉病毒中，扎伊尔种的毒力最强，Reston 种的毒力最弱。猴子感染马尔堡病毒后也能存活，其毒力与埃博拉病毒苏丹种相当。其他猴子以及豚鼠也是非常好的实验模型。已有埃博拉病毒（扎伊尔种）的小鼠模型，用于细胞生物学和免疫学研究，但是小鼠模型与人类感染情况相差较远，从这些研究中获得的实验数据不能直接应用到人身上。

③ MACV 和 JUNV 病毒最常用的动物是新生鼠或田鼠，沙粒病毒也可以用小的豚鼠，一般 7~18 天引起死亡。豚鼠也可用于丝状病毒的分离培养，但丝状病毒初代培养只引起豚鼠发热，传代后才引起死亡。小鼠对 ZEBOV 敏感，但对其他丝状病毒不敏感。乳鼠是分离 CCHFV 的经典动物。

（二）电子显微镜

电子显微镜可以用来观察病毒的超微结构，丝状病毒科是感染人类的唯一丝状病毒，所以电镜可以直接将其与其他病毒区分。丝状病毒感染的患者的抗凝血液、尿液和组织均可用电子显微镜观察到病毒。沙粒病毒细胞培养样品呈沙粒状，电镜下也可与其他病毒区分。但电子显微镜观察不能作为鉴定病毒的方法。

（三）检测抗原

A 酶联免疫吸附试验检测（ELISA）病毒抗原 ELISA 是诊断各种出血热的敏感和特异的方法，可以用来检测 γ-射线照射过的或经 β- 丙内酯（β-propionolactone）灭活过的血清、组织培养上清液、尿液、咽喉清洗液。酶标板用抗体包被，检测患者血清中的病毒抗原，第二抗体采用标记的多抗比单抗更敏感。如果样品的 A410 超出阴性对照 A410“均数＋3 倍标准差” 可判定为阳性。检测的敏感度一般为（1.3~3.2）x 10 PFU/ml。

B 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）免疫组织化学染色经常用来检测沙粒病毒和丝状病毒。甲醛固定的组织经过切片固定到硅烷（silane）包被的玻片上，再经过脱蜡、与抗体和抗抗体反应后进行病毒的检测。IHC 对于检测皮肤等组织中的丝状病毒非常有效。

（四）检测病毒特异性抗体

A 间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）间接免疫荧光法是检测患者血液中病毒抗体的常用方法，可以用来检测所有出血热病毒感染。IFA 简单，但结果判定比较主观，另外大部分出血热病毒没有商业化的抗原片，所以越来越被 ELISA 所取代。患者血清需要从 1:4 或 1:8 开始，对倍稀释。阳性是指在 1:64 或更高稀释度的血清能够出现清晰典型荧光。

B 酶联免疫吸附试验（ELISA）随着商品化的 ELISA 试剂盒的应用，ELISA 已被广泛用于检测各种出血热病毒感染。ELISA 可以分别检测 IgM 和 IgG 抗体。IgM 阳性说明患者有近期感染。如果样品的 A410 超出 “阴性对照 A410 均数＋3 倍标准差” 可判定为阳性。在我国肾病综合征出血热和发热伴血小板减少综合征均有 ELISA 抗体检测试剂盒。在国外，沙粒病毒的 LASV、JUNV 和 MACV，还有 CCHFV 的抗体均可用 ELISA 检测。因为 NP 是出血热病毒的主要抗原，所以肾病综合征出血热、发热伴血小板减少综合征、CCHFV 和 LASV 的 ELISA 试剂盒都用 NP 的重组蛋白作为 ELISA 试剂盒的抗原。

C 空斑减少中和试验（plaque-reduction neutralization tests，PNRT） 空斑减少中和试验检测血清中中和抗体。中和抗体与病毒结合可以阻止病毒与受体结合，阻止病毒被细胞吞噬，或阻止病毒脱壳。有包膜的病毒与中和抗体结合后激活补体，可以使病毒裂解。通过这些效应，中和抗体能够阻止病毒感染细胞，使病毒的感染率下降。人血清中中和抗体的产生需要几个星期，一旦产生中和抗体可以持续几年。空斑减少中和试验既可以用于检测患者血清中抗体的消长情况，也可用来鉴定未知病毒或对病毒进行半定量。检测抗体时，一般稀释含有中和抗体的血清，检测病毒时，一般需稀释病毒。血清稀释液中需要含有补体，因此常在稀释液中加入 10％的豚鼠血清作为补体来源，然后把中和抗体与待检测病毒混合，再感染细胞，观察空斑数量。中和抗体的滴度用中和指数表示。

（五）核酸检测

A 反转录 PCR（RT-PCR）RT-PCR 方法简单、敏感、特异，可以对灭活的病毒进行检测，特别适用于无法进行病毒分离的标本。现在 RNA 提取和 RT-PCR 都用试剂盒，所以 RT-PCR 非常方便。RNA 抽提液一般含有硫氰酸胍（guanidinium thiocyanate），其足以灭活各种出血热病毒，但做 RNA 抽提要在生物安全柜中进行。

每种病毒的 RT-PCR 都有特异引物，这些引物往往选自于同一种病毒比较保守的区域。单纯用一对引物 RT-PCR 阳性作为诊断某个病毒感染是不够的，需要有病毒分离或血清学阳性的证据。如果没有病毒分离或血清学证据，至少要用扩增不同部位的第 2 对引物证实病毒感染。RT-PCR 的灵敏度为检测 10RNA 模板/ml，实时 RT-PCR 比 RT-PCR 的灵敏度高，能够检测到 1500~3000 个病毒 RNA 模板/ml。

B 原位杂交（in situ hybridization）用与病毒 RNA 序列匹配的探针与活检的组织样品中的 RNA 杂交可以检测埃博拉和克里米亚 - 刚果出血热，但其他病毒未见报道。