病毒染色标本的制备

四、材料与仪器

待检测病毒
丙酮 0. 01mol L PBS 95%乙醇 二甲苯
玻片

五、步骤

1. 培养细胞小玻片标本的制备 根据所检测病毒种类，选择敏感细胞进行培养，如乙型肝炎病毒用乳地鼠肾细胞 (BHK21 细胞）培养，森林脑炎病毒用绿猴肾细胞 (Vero 细胞）培养，登革热病毒用白纹伊蚊传代细胞 (C6/36 细胞）培养。

按细胞培养方法，将其分装在有盖玻片的培养板或培养瓶中，置 37℃温箱培养成单层细胞，然后接种病毒。接种病毒量及培养时间因病毒种类而异。

如乙型肝炎病毒接种的病毒滴度为约 10-5, 培养 24 h 收片；森林脑炎病毒接种的病毒滴度为 10-6 ,24 h 收片；登革热病毒接种的病毒滴度为 10-6,48 h 收片。

设未接种病毒的正常细胞作对照。感染和对照标本从培养板或培养瓶中取出后用 0. 01mol/L PBS 漂洗 2 次，放滤纸上，干燥后放预冷丙酮中置- 30~-28℃冰箱中固定 30 min, 取出小片，室温干燥后装小瓶密封，置 4℃冰箱保存备用。

2. 鼻咽部上皮细胞涂片制备。患者先排净鼻咽部分泌物后，将蘸有生理盐水的鼻咽拭子顺下鼻道插入，擦拭鼻咽处或咽部扁桃体周围及前后咽壁，尽量获取上皮细胞，然后向清洁载玻片上轻压棉拭子，制成薄而均匀的涂片。每标本作 4-5 片，放室温晾干后，滴加冷丙酮置 4℃冰箱中固定 10 min, 室温下干燥后，置 4℃冰箱保存或立即染色检测。

3. 石蜡切片标本的制备从放血处死的小白鼠或尸检材料中，取鼠脑或其它组织材料，切3-4mm 小片，置 95% 乙醇中 4℃固定 24 h 。在 4℃下经无水乙醇 I、II容器内顺次脱水，每容器1 h 。再用二甲苯浸 15-30 min 至透明为止。将组织块放 56℃浸蜡 30 min, 制成蜡块，切片厚度为 6-8 µm。经二甲苯脱蜡， 95% 乙醇脱去二甲苯，再染色。具体方法同病理组织切片制备。蜡块可保存一年，经荧光染色仍保持抗原性和着色力。

4. 冰冻切片标本制备 将上述小白鼠按需要选择部位或尸检材料，切厚度为 3-5mm 小块，放冰冻切片机冷冻台上，用普通浆糊作支持物作冷冻切片，厚度为 4-7µm, 夏季室温超过20℃以上可用 60 g/L 明胶作支持物，也可将切片机置于 4℃卧式低温冰箱中进行。玻片粘片后立即放丙酮中，室温固定 10-15min, 即可荧光染色。

5. 鼠脑及尸检材料印片制备

(1) 热印片法：将载玻片通过酒精灯火焰数次，待温度达 40℃左右时取脑组织轻轻印片，放室温干燥，在室温中用丙酮固定 10 min, 即可进行染色。

(2) 冷印片法：将载玻片放-20℃低温预冷，也可采用乙醇加二氧化碳干冰降温。将材料迅速印片，立即放入干燥缸中干燥后，置丙酮中固定 10 min, 即可染色。

六、注意事项