分枝杆菌的培养和鉴定

分枝杆菌培养包括改良罗氏培养和液体培养（如 BD MGIT 960 液基培养）。目前，固体罗氏培养法是我国最常用的实验室结核杆菌培养方法，该方法非常具有代表性。

结核杆菌在固体培养基上生长，菌落形态清晰可见，其中菌落形态较典型的样本可以通过直接观察菌落的形态即可做鉴别，因此固体罗氏培养法常用于临床疑似结核病标本的分离培养、鉴别、保存菌种及抗结核药物敏感性测定等。而且相较于涂片检查法，改良罗氏固体培养阳性率更高。

在加热条件下，分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸可与复红染液牢固结合成复合物，经盐酸酒精处理后也不会脱色，因此再加染后分枝杆菌仍然呈现红色，而背景和其他杂菌中则呈蓝色。

目前，Ziehl-Neelsen 痰涂片镜检也是我国结核病相关实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，实验成本低。

荧光色素金胺「O」是一种含有自由氨基的金黄色碱性染料，能产生较强的荧光色素，且具有选择性，其离子带有阳电荷，而结核杆菌带有阴电荷，因此金胺「O」能和带阴电荷的抗酸杆菌结合而着色，在荧光显微镜中的高压汞灯的紫蓝光照射激发下，使带金胺「O」染色的结核菌发出很强的桔黄色荧光，检查时用高倍镜即可查见明亮细菌。 

4% NaOH 标本前处理液、离心试管

罗氏培养基、温箱

以痰标本为例，培养和鉴定分枝杆菌的步骤如下：

1、挑取约 5 mL 痰液至 50 mL 已标记的离心试管中。

2、加入 1~2 倍的 4% NaOH 标本前处理液：旋涡振荡 1~2 min。

3、室温静置 15~20 min，勿超过 20 min。

4、加入无菌 PBS（PH 6.8）至约 45 mL，盖紧盖子。

5、离心 3000 g，15 min，倒掉上清液。

6、添加 1~3 mL PBS（PH 6.8）以中和 PH 至 6.8。

7、取 0.1 mL 接种至 2 支培养基斜面培养管。

8、标本前处理的判断标准：以污染率 3~5% 为佳。

9、置于 37 ℃ 温箱培养。

10、接种后 3 天，7 天各观察 1 次菌落生长情况，发现菌落生长者，则进行分枝杆菌鉴定。此后每周观察一次，记录菌落生长及污染情况。

11、有菌落生长需进行染色确认，培养至第 8 周无菌落生长则可初步判断为“分枝杆菌培养阴性”。

12、培养基发现阳性菌落生长后，在生物安全柜中从培养基上挑取少量菌落接种于罗氏培养管，并进行直接涂片（可将培养液与 5% 石碳酸溶液在玻片上混合以杀灭分枝杆菌），涂片用紫外线照射 1 h 后方可从生物安全柜中取出。对涂片进行荧光金胺 O 染色；

13、荧光金胺 O 染色阳性应进行萋尼氏抗酸染色进一步确认；

14、萋尼氏抗酸染色阳性则使用培养液进一步进行结核分枝杆菌抗原金标法检测；

15、此外也可通过 DNA 测序进行菌种鉴定。其操作流程可分为基因组提取 - PCR 扩增 - Sanger 测序（具体流程参见 DNA 测序实验流程）。

1. 可适当调整 NaOH 的浓度从而调整污染率。

2. 标本前处理液请在 24 h 内使用。