新冠病毒实验室检测技术指南

实验室检测人员应当具有实验室工作经历以及相关专业技术技能，接受过新冠病毒相关检验检测技能培训。检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检测人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。

（二）实验室检测

1.实时荧光RT-PCR方法检测新冠病毒核酸

（1）核酸检测实验室

新冠核酸检测实验室按功能区布置位置的不同，可分为集中布置形式和分散布置形式。开展新冠病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。如采用标本加样、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，标本制备区、扩增和产物分析区可合并。集中布置形式的实验室设置应遵循“各区独立，单向流动（注意风向，压力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原则。各区的功能如下：

①试剂储存和准备区

用于分装、储存试剂、制备扩增反应混合液，以及储存和准备实验耗材。该区应配备冰箱或冰柜、离心机、试验台、涡旋振荡器、微量加样器等。为防止污染，该区宜保持正压状态。

②标本制备区

标本转运桶的开启、标本灭活（必要时）、核酸提取及模板加入至扩增反应管等。该区应配备冰箱或冰柜、生物安全柜、离心机、试验台、微量加样器，可根据实际工作需要选配自动化核酸提取仪等。标本转运桶的开启、分装应在生物安全柜内完成。为防止污染，该区宜保持负压状态。为操作方便，标本的分装以及核酸提取也可以在独立的生物安全二级（BSL-2）实验室进行，提取的核酸可以转运至该区加至扩增反应液中。

③核酸扩增和产物分析区

进行核酸扩增反应和产物分析。该区应配备实时荧光定量PCR仪。为防止扩增产物污染环境，该区宜保持负压状态，压力等于或低于标本制备区。 

（2）新冠病毒核酸的荧光定量RT-PCR检测

实验室应当制定标准操作程序（SOP），并严格按照SOP进行操作。接到标本后，应当在生物安全柜内对标本进行清点核对，并依据SOP进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、核酸扩增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本复检的流程。

①试剂准备

应当选择国家药品监督管理部门批准的试剂，建议根据核酸提取试剂及扩增体系的要求选择配套的标本采样管，不建议免提取核酸直接进行核酸扩增反应。

②标本处理

使用含胍盐等灭活型采样液的标本无需进行灭活处理，可直接进行核酸提取，而使用非灭活型采样液的标本，按照核酸提取试剂盒的说明，取适量标本加至核酸提取裂解液中充分混匀作用一定的时间则可以有效灭活病毒。选用热灭活时可采用95℃加热15分钟，不推荐采用56℃孵育30分钟的处理方式灭活病毒，该条件不能保障充分灭活病毒。污水水样标本处理可参考《污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准》（WS/T 799-2022）推荐的方法；污水拭子标本处理可参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T776-2021）推荐的方法。

③核酸提取

将灭活后的标本取出，在生物安全柜内打开标本采集管加样，或按照核酸提取试剂盒的说明，将标本与裂解液作用足够时间后继续核酸提取步骤，核酸提取完成后立即封盖。取适量核酸加至PCR扩增反应体系中。

④核酸扩增

将扩增体系放入荧光定量PCR仪，按照试剂盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。扩增完成后反应管不可开盖，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高压，按一般医疗废物转移出实验室处理。检测机构所选用的新冠病毒核酸检测试剂应针对新冠病毒基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）基因，人体标本检测原则上选择含内源性内参的核酸检测试剂。

⑤阳性标本的确认

实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：条件一：同一份标本中新冠病毒2个靶标（ORF1ab、N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新检测或重新采样复核。条件二：两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。环境与生物材料核酸检测阳性要排除疫苗接种物残留污染的影响。核酸检测结果假阴性的可能原因包括：标本质量差；标本采集时间过早或过晚；标本保存、运输和处理不当；其他原因如病毒变异、PCR抑制等。

⑥质控

由上级疾控部门对下级疾控实验室进行核酸检测质控考核，中国疾控中心每年至少开展一次对省级疾控机构实验室的质控考核，并同时提供全国新冠病毒实验室检测质控方案，省级针对地市级实验室的质控考核每年不少于两次。各检测机构应当加强核酸检测质量控制，选用扩增检测试剂盒指定的核酸提取试剂和扩增仪。

性能验证。临床标本检测前，实验室应对核酸提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和最低检测限。

室内质控。实验室可按照《国家卫生健康委办公厅关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》（国卫办医函〔2020〕53号）要求规范开展室内质控。每批检测至少有1份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的1.5-3倍）、3份阴性质控品（生理盐水）。质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。大规模人群筛查时，一旦出现阳性结果，应对阳性标本采用另外一到两种更为灵敏的核酸检测试剂对原始标本进行复核检测，复核阳性方可报出。

物品和环境标本的采集检测，还需在采样前及采样过程中至少设一个现场空白标本及一个运输空白标本，以进行过程中的质量控制。

室间质评。实验室应常态化参加国家级或省级疾控机构组织的室间质评。对检测量大以及承担重点人群筛查等任务的实验室，可适当增加室间质评频率。不按要求参加室间质评的，或室间质评结果不合格的，应通报批评并上报国家卫健委，待室间质评通过后方可开展核酸检测。

核酸检测实验室质控详细内容参见《国家卫生健康委办公厅关于加强疾控机构新冠病毒核酸检测实验室质量控制的通知》（国卫办疾控函〔2021〕548号）《疾控机构新冠病毒核酸检测质量控制方案》。

2.病毒全基因组测序

病毒全基因组测序可以监测病毒基因组突变，为新冠病毒核酸检测试剂、疫苗研发策略的改变提供实验数据，同时也为流调溯源工作提供支持。

（1）测序标本选取原则

结合流调信息和病例传播链关系，优先选择以下标本开展测序：核酸检测Ct值≤32 的本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、境外输入病例、入境物品及相关环境阳性标本、疫苗接种后核酸检测阳性者标本等。测序结果应与本地近一个月的输入病例和本土病例序列进行比对。对同一传播链或流行病学关系明确的病例无需全部测序。 

（2）测序要求

①测序单位和流程

以省、自治区、直辖市为单位确定开展新冠病毒全基因组测序的机构，包括省级疾控机构和科研机构；具备测序条件的省份要在接收标本后24小时内开展测序工作。不具备测序条件的省份要及时将标本送至病毒病所，病毒病所收到标本后及时启动序列测定工作。

②结果报告与反馈

各省份要建立本省输入、本土病例新冠病毒基因组数据库，及时进行序列比对分析，逐步提高自主分析能力。获得的全部测序数据都必须上报中国疾控中心病毒病所用于我国新冠病毒溯源数据库的更新与维护。对本土疫情的指示或首发病例、本土疫情中由不同基因型的毒株导致的新传播链的指示或首发病例，测序完成后应于24小时内将数据报送病毒病所，病毒病所确认数据完整无误后于48小时之内反馈结果；对本土疫情中归属已知传播链的病例、境外输入病例、环境标本（非指示或首发病例相关），测序数据于每周周一上午集中上报，病毒病所确认数据完整无误后于一周之内反馈结果。

3.血清抗体检测

血清抗体检测用作新冠病毒核酸检测的补充检测，也用于评估疫苗接种后诱发的免疫反应。应采用中国药品监督管理局批准的试剂进行检测，采集急性期（发病7天内）和恢复期（3-4周后）双份血清进行检测，也可根据临床需要确定采集时间，疑似新冠病毒感染者抗体检测阳性时应排除新冠疫苗接种因素的影响。

4.病毒分离培养

（1）病毒分离培养对象

对核酸检测Ct值≤30的所有境外输入病例的标本、本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例以及疫苗接种后核酸阳性者标本开展病毒分离培养。

 （2）毒株报送与结果反馈

具有新冠病毒分离、培养资质的省级疾控机构应开展病毒分离培养工作，收到关键标本后96小时内开展相关工作，在获得分离毒株后96小时内将毒株送病毒病所保存备案，并将毒株序列等相关信息报送病毒病所。不具备病毒分离条件的省份，要在病例报告后48小时内启动送样流程，将标本送达病毒病所，病毒病所收到标本后应在96小时内启动病毒分离工作，获得毒株后96小时内反馈分析结果。

5.抗原检测

不具备开展核酸检测条件的基层医疗卫生机构、隔离观察人员和有抗原自我检测需求的社区居民可以进行抗原检测。抗原检测不作为确诊病例或无症状感染者诊断的依据，仅用作核酸检测方法的补充，实现“快筛快检”，提高感染者发现的及时性。具体实施流程及要求参照《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》（联防联控机制综发﹝2022﹞21号）执行。